Перспективы инновационной технологии хранения промышленных микроорганизмов контактно-сорбционным методом

Были разработаны и испытаны 6 вариантов контактно-сорбционного метода, все они показали эффек­тивность их применения, которое оценивалось с учетом максимального показателя жизнеспособно­сти. В качестве сорбента были взяты отечественные препараты «Тагансорбент» с ионами серебра, «Алтайсорбент» (ТОО «Сорбент», г. Усть-Каменогорск, РК).Также были отобраны наиболее доступ­ные, простые в использовании и менее затратные варианты закладки на хранение контактно-сорбционным методом. 

Введение

Актуальной остается проблема разработки комплексного подхода к консервации микроорганиз­мов, учитывающего как известные сведения о процессах, выработанных естественным отбором и способствующих сохранению микроорганизмов в природе, так и эмпирические достижения лабора­торного хранения.

Длительное хранение клеток без утраты ценных свойств проводится методами, обеспечивающи­ми существенное торможение протекающих у них жизненных процессов. Это достигается путем глу­бокого замораживания микроорганизмов или их высушивания из замороженного (лиофилизация) ли­бо непосредственно из жидкого состояний (L-высушивание). Известно, что при длительном хранении культур микроорганизмов в музейных условиях, отличающихся от природных и производственных, некоторые свойства коллекционных культур ослабевают или даже утрачиваются [1, 2].

Одно из решений существующей проблемы по эффективному сохранению и развитию ресурсов промышленных коллекций заключается во внедрении методов хранения ценных культур современ­ными технологиями с использованием субкультивирования контактно-сорбционным методом на раз­личных носителях.

Успешность лабораторных программ консервации, несомненно, может быть повышена, если бу­дут использоваться популяции клеток, реализующие свойственные им процессы «самоконсервации» либо индуцированные к этому соответствующими экспериментальными воздействиями с использо­ванием различных инновационных методов хранения, в том числе субкультивирование с использова­нием контактно-сорбционного метода на различных носителях [3].

Материалы и методы

Объекты исследования: коллекционные культуры — бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы, бациллы, лактобактерии, различные сорбенты отечественного производства. Методы исследования: микробиологические.

Оценка жизнеспособности и культурально-морфологических свойств микроорганизмов различ­ных таксономических групп коллекции, заложенных на хранение субкультивированием контактно-сорбционным методом на носителях, путем их сравнения для определения преимуществ и недостат­ков того или иного носителя [4].

Культуральные признаки изучали на плотных и жидких питательных средах. Инкубировали в зависимости от таксономической группы при оптимальной температуре до 2-7 суток. Описание ха­рактера роста на жидких питательных средах оценивали по следующим признакам:

1) наличие при­стеночного кольца;

2) наличие, характер, толщина поверхностной пленки;

3) характер и интенсив­ность мути;

4) цвет, структура, количество осадка.

Оценка показателя жизнеспособности культур микроорганизмов методом Miles&Misra и опре­деление количества жизнеспособных клеток культуры методом последовательных посевов [5, 6].

Результаты и обсуждение

Нами были испытаны 6 вариантов контактно-сорбционного метода, все они показали эффектив­ность их применения, которое оценивалось с учетом максимального показателя жизнеспособности. В качестве сорбента брали отечественные препараты «Тагансорбент» с ионами серебра, «Алтайсор-бент» (ТОО «Сорбент», г. Усть-Каменогорск, РК) на первом этапе хранения.

В ходе работы установлено, что показатель жизнеспособности стабилен при хранении во всех шести вариантах. Поэтому нами был проведен сравнительный анализ этапов подготовки каждого ва­рианта с учетом доступности, простоты в использовании и менее затратных вариантов закладки на хранение контактно-сорбционным методом.

Недостатки 1-го варианта: на этапе стерилизации сорбента при температуре 110 °С тратилось мно­го времени, т.е. 20-22 ч. Перед началом работ пробирки с сорбентом влаги охлаждали в течение 1-2 ч при температуре минус 20 °С, также проводили дополнительную процедуру, требующую времени.

Недостатки 2-го варианта: проведение контактно-сорбционного обезвоживания целевого про­дукта (микроорганизмы) на 2 этапе требуется охлаждать до минус 8-10 0C сорбентом с остаточной влажностью менее 1 % при массовом соотношении 1:10, требуется дополнительное время на охлаж­дение и регламентацию остаточной влажности.

Недостатки 4-го варианта: полученную клеточную суспензию смешивают с охлажденным до -18...-22 °С сорбентом в соотношении 1:6,5-7,5, проводится дополнительная процедура охлаждения. На этапе досушивания при комнатной температуре требуется по регламенту длительное время, т.е. 65-72 ч (до 3-х суток) в запечатанных пробирках.

Недостатки 5-го варианта: высушивали нелиофильным способом в течение 48 ч при температуре 50 °С, использовался адсорбционный метод сушки культуры, этот фактор (50 °С) отрицательно влиял на культуральные свойства, вызывая изменения S-формы колоний в R-форму, практически все штаммы дрожжей диссоциировали в данном варианте.

В силу этих причин для дальнейшей работы были отобраны наиболее доступные, простые в ис­пользовании и менее затратные варианты закладки на хранение контактно-сорбционным методом: 3 и 6, которые при текущем этапе работы, с учетом всех результатов и количества отработанной сус­пензии и защитной среды, были признаны эффективными.

В вариантах контактно-сорбционного метода также были отработаны следующие положения:

  1. Отработан объем суспензии (250 мкл суспензии микроорганизмов + 250 мкл 10 % молока), при внесении в адсорбент образуется минимум жидкости, при этом меньше времени уходит на сушку при использовании 3 и 6 вариантов.
  2. Количество адсорбента 200 мг является наиболее оптимальным для поглощения 500 мкл жид­кости.

Также нами в ходе работы была выбрана наиболее упрощенная схема реактивации. Реактивацию после консервации методом КСО проводили введением в часть пробирок физиологического раствора, охлажденного до 2-4 °С, в часть пробирок неохлажденного физиологического раствора, с последую­щим высевом 0,1 мл содержимого на плотную питательную среду. При сравнении использованных физиологических растворов, охлажденного до 2-4 °С и неохлажденного, не установлено влияния раз­ницы на результаты, поэтому мы исключили процедуру охлаждения физиологического раствора. В дальнейших исследованиях предусмотрена серия опытов по лиофилизации дубликатов культур ва­риантов, заложенных на хранение контактно-сорбционным методом.

Микроскопия препаратов, приготовленных из коллекционных микроорганизмов различных так­сономических групп, заложенных на хранение контактно-сорбционным методом с использованием «Тагансорбента» и «Алтайсорбента» на 3-м и 6-м вариантах КСО, показала полное соответствие морфологии клеток исходным данным до закладки на хранение и паспортным данным по этому при­знаку.

Для продолжения экспериментального исследования на втором этапе нами были использованы отобранные варианты заложенных на хранение контактно-сорбционным методом: 3 и 6 с использо­ванием «Тагансорбента» и «Алтайсорбента» выше приведенных коллекционных штаммов микроор­ганизмов различных таксономических групп. Была определена эффективность хранения микроорга­низмов контактно-сорбционным методом через 3 месяца с их количественной оценкой ЖСП по мето­ ду Miles&Misra и методом последовательных посевов, контролем количественной оценки служил качественный показатель высева штамма после реактивации (табл. 1).

Количественная характеристика микроорганизмов через 3 месяца хранения на 3-м варианте с использованием «Тагансорбента» и «Алтайсорбента

Окончательный вариант реактивации после консервации методом КСО включает: введение в пробирки с испытуемым штаммом физиологического раствора с последующим высевом 0,1 мл со­держимого на соответствующую данному микроорганизму плотную питательную среду (см. рис.).

На рисунке показана количественная характеристика МКБ через 3 месяца хранения с использо­ванием «Тагансорбента» и «Алтайсорбента» после реактивации и титрования.

Количественная характеристика МКБ Lactobacilluscasei MRKM 0003 через 3 месяца хранения с использованием «Тагансорбента» и «Алтайсорбента» после реактивации и титрования

Количественная характеристика микроорганизмов через 3 месяца хранения на 6-м варианте с использованием «Тагансорбента» и «Алтайсорбента»

Рисунок. Количественная характеристика МКБ Lactobacilluscasei MRKM 0003 через 3 месяца хранения с использованием «Тагансорбента» и «Алтайсорбента» после реактивации и титрования

Результаты количественной и качественной оценок эффективности хранения коллекционных микроорганизмов различных таксономических групп контактно-сорбционным методом с использо­ванием «Тагансорбента» и «Алтайсорбента» через 3 месяца, их культурально-морфологическая ха­рактеристика и анализ литературы по данной проблеме позволили нам сделать некоторые обоснова­ния и требования при использовании данного метода.

  1. Сущность метода КСО заключается в обезвоживании микроорганизмов при контакте с сор­бентом влаги, в результате чего микроорганизмы теряют воду и метаболические процессы резко за­медляются.
  2. КСО с использованием «Тагансорбента» и «Алтайсорбента» позволяет консервировать и со­хранять различные группы микроорганизмов без потери ими своих основных биологических свойств (морфологических и культуральных, изученных нами на этом этапе).
  3. Предпочтительнее использовать в качестве защитной при КСО минимальные среды, посколь­ку в них процессы метаболизма микроорганизмов идут с пониженными скоростями и поэтому про­межутки между пересевами удлиняются.
  4. При использовании комплексной среды могут потребоваться более частые пересевы, связан­ные с ускоренным ростом микроорганизмов или накоплением конечного продукта метаболизма.
  5. Для уменьшения высыхания культур необходимо использовать пробирки с завинчивающими­ся крышками или резиновые пробки (если нет необходимости высушивания).
  6. Для уменьшения скорости метаболизма микроорганизмов культуры необходимо хранить в бытовом холодильнике при температуре 5-8 °С (кроме условий хранения при других показателях).
  7. Частоту пересевов определяют экспериментальным путем, стараясь проводить их как можно реже во избежание селекции вариантов.
  8. Используя эти меры предосторожности, можно сохранять большинство бактерий в течение 3-5 месяцев и более без пересева (сроки наблюдения на данном этапе).
  9. Реактивацию после консервации проводят введением в пробирку или флакон физиологическо­го раствора с последующим высевом 0,1 мл содержимого на плотную питательную среду (через определенные сроки хранения).
  10. КСО не требует специального оборудования, значительных физических и экономических за-
    трат.

Таким образом, контактно-сорбционный метод, не требующий специального оборудования, зна­чительных физических и экономических затрат, позволяет консервировать и длительно сохранять различные группы микроорганизмов без потери ими своих основных биологических свойств.

Из изложенного выше можно сделать следующее заключение:

Были разработаны и испытаны 6 вариантов контактно-сорбционного метода, все они показали эффективность их применения, которое оценивалось с учетом максимального показателя жизнеспо­собности. В качестве сорбента были взяты отечественные препараты «Тагансорбент» с ионами сереб­ра и «Алтайсорбент» (ТОО «Сорбент», г. Усть-Каменогорск, РК) на первом этапе хранения.

В ходе работы было установлено, что показатель жизнеспособности стабилен при хранении во всех шести вариантах контактно-сорбционного метода. При проведении сравнительного анализа эта­пов подготовки каждого варианта отобраны для дальнейших исследований 3-й и 6-й варианты.

При испытании различных вариантов контактно-сорбционного метода также были отработаны и оптимизированы следующие положения:

  • отработан объем суспензии и защитной среды (250 мкл суспензии микроорганизмов + 250 мкл 10 % молока), при внесении в адсорбент образуется минимум жидкости, при этом меньше времени уходит на сушку при использовании отобранных вариантов;
  • количество адсорбента 200 мг является наиболее оптимальным для поглощения 500 мкл жид­кости;
  • также нами в ходе работы была выбрана наиболее упрощенная схема реактивации после хра­нения на адсорбентах.

Выводы

  1. Заложены 50 штаммов микроорганизмов 5 таксономических групп на различные сроки хране­ния контактно-сорбционным методом с использованием препаратов «Тагансорбент» и «Алтайсор-бент» в качестве носителей.
  2. Проведено изучение качественных и количественных показателей 50 коллекционных штам­мов промышленных микроорганизмов: бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов, бацилл, лактобак-терий, заложенных на хранение контактно-сорбционным методом.
  3. Проведен сравнительный анализ этапов подготовки каждого варианта с учетом доступности, простоты в использовании и менее затратных вариантов закладки на хранение контактно-сорбцион-ным методом на адсорбентах, и отобраны для дальнейших исследований 3-й и 6-й варианты.
  4. КСО с использованием «Тагансорбента» и «Алтайсорбента» позволяет консервировать и со­хранять различные группы микроорганизмов без потери ими своих основных биологических свойств (морфологических и культуральных, изученных нами на этом этапе).
  5. Предпочтительнее использовать в качестве защитной при КСО минимальные среды, посколь­ку в них процессы метаболизма микроорганизмов идут с пониженными скоростями и поэтому про­межутки между пересевами удлиняются.
  6. Для уменьшения высыхания культур необходимо использовать пробирки с завинчивающими­ся крышками или резиновые пробки (если нет необходимости высушивания).
  7. Для уменьшения скорости метаболизма микроорганизмов культуры необходимо хранить их в бытовом холодильнике при температуре 5-8 °С (кроме условий хранения при других показателях).

 

 

 

Список литературы

  1. Лозина-Лозинский Л.К. Адаптация и устойчивость организмов и клеток к низким и сверхнизким температурам // Очерки по криобиологии — Л.: Наука, 1972. — 288 с.
  2. Maintenance of microorganisms: A manual of laboratory methods / Ed. by B.Kirsop, J.Snell. — London: Acad. Press, — 207 p.
  3. Porter J.N. Cultural conditions for antibiotic-producing microorganisms // Methods in enzymology. —Y.: Acad. Press, 1975. — Vol. 43: Antibiotics. — P. 3-23.
  4. Smith D. The preservation and maintenance of living fungi / D.Smith, A.H.S.Onions. Kew (Richmond); Surrey (England): Commonwealth Mycol. Inst. Publ., — 51 p.
  5. Бекер М.Е., Рапопорт А.И., Калакуцкий Л.В. Торможение жизнедеятельности клеток. — Рига: Зинатне, 1987. —240 с.
  6. Бузолева Л.С. Некультивируемые формы бактерийYersiniapseudotuberculosisпри периодическом культивировании // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. — 2000. — Т. 129, № 4. —C. 444-447.
Фамилия автора: У.Т.Арыкпаева, К.Х.Алмагамбетов, К.А.Калдарбекова, Б.Б.Динкаева, А.С.Махатова, А.А.Ескараева, Р.К.Ергебаева
Год: 2014
Город: Караганда
Категория: Биология
Яндекс.Метрика