Полиморфизмы гена TNFa (-308 и -238) у больных туберкулезом легких представителей русской популяции Челябинской области

В статье отмечено, что для определения взаимосвязи между SNPs гена TNF и предрасположенностью к туберкулезу впервые было проведено генотипирование частоты встречаемости SNPs -308 G/A TNFa и -238 G/A у больных туберкулезом легких представителей русской популяции Челябинской области. Установлено, что развитие возникшей инфекции M. tuberculosis в значительной степени обусловлива­ется наследуемыми факторами предрасположенности к туберкулезу. Показано, что аллель TNF-238*A, генотип TNF-238*G/A и гаплотип -308G/-238A являются факторами предрасположенности к туберкулезу легких в русской популяции Челябинской области.

Туберкулез является одной из наиболее социально значимых инфекций. Рассматривая проблему туберкулеза на молекулярном и клеточном уровнях, вероятно, нельзя четко разграничить значение биологических свойств M. tuberculosis и иммунной системы макроорганизма. Исследование генети­ческих основ подверженности туберкулезу — одна из наиболее активно разрабатываемых в настоя­щее время проблем. На данный момент выявлен ряд генетических маркеров повышенной чувстви­тельности к туберкулезной инфекции — дефекты генов системы воспаления: рецептора IFNy, генов IL12, TNFa, IL10, IL1, генов иммунного ответа: HLA, TLR, а также системы метаболизма: VDR, NRAMP [1].

TNFa — основной цитокин в противотуберкулезном иммунитете, так как в синергизме с IFNy участвует в формировании и поддержании гранулемы. Низкая продукция TNFa недостаточна для ак­тивизации макрофагов до того уровня, когда они способны убивать микобактерии и/или формировать гранулемы, отграничивающие инфекционные локусы [2]. Повышенная продукция TNFa усиливает прогрессирование туберкулеза через локальные повреждения тканей и повышает вирулентность са­мих микобактерий. Установлено, что повышенное, в сравнении с нормой, количество TNFa усилива­ет рост M. tuberculosis в альвеолярных макрофагах больных. По мнению тех же авторов, микобакте-рии «преднамеренно» усиливают продукцию TNFa инфицированными макрофагами для «привлече­ния» к очагу инфекции неинфицированных макрофагов, затем индуцируют апоптоз инфицированных макрофагов и распространяются по неинфицированным макрофагам [3]. Избыток TNFa приводит к альтерации ткани. То, какую роль играет TNFa при туберкулезе (протективную или деструктив­ную), зависит, по-видимому, от его количественного содержания в тканях: слишком высокая продук­ция вызывает выраженные воспалительные изменения в легких, а недостаток TNFa снижает иммун­ный надзор организма, что сопровождается глубокой дизрегуляцией иммунного ответа, нарушением процесса гранулемообразования, неспособностью контролировать рост M. tuberculosis, вследствие чего могут развиться тяжелые, остропрогрессирующие формы туберкулеза легких [4].

Ген TNFa расположен на 6 хромосоме в локусе, внутри кластера генов III класса HLA между HLA B и HLA DR генами в позиции 6р23чД2 и находится в неравновесном сцеплении с генами HLAII класса. Ген TNFa является одним из самых полиморфных генов цитокинов. Его промоторно-энхансерная область содержит от 9 до 13 полиморфных сайтов типа SNPs. Однако наиболее значи­мые для человека — это замены гуанина на аденин в положениях -308 и -238. Позиции -308 и -238 приходятся на промотор, что сказывается на возможности транскрипционных факторов связы­ваться с этой частью гена и, таким образом, влиять на скорость транскрипции [5]. Данные нуклеотид-ные замены — явление достаточно распространенное, к примеру, среди европейцев около 27-33 % в своем генотипе содержат полиморфный (редкий) аллель TNFa-308*A и около 7-10 % — редкий аллель TNFa-238*A. Аллель TNFa-308*A является более сильным активатором транскрипции с 6-7-кратным повышением индуцируемого уровня транскрипции гена TNFa [6]. Наряду с этим для другого полиморфного варианта гена TNFa-238, аллель A ассоциирован с понижением продукции TNFa [5].

Исследования, посвященные связи генотипа TNFa с инфекционным процессом, вызванным ми-кобактериями, дали противоречивые результаты. Полиморфный аллель TNFa-308*A является факто­ром риска при туберкулезе у башкир [7] и среди азиатов [8]. В исследованиях Correa P. et al. обнару­жена ассоциация с заболеванием туберкулезом низкопродуктивных аллелей TNFa-308*G и TNFa-238*A и доказана протективная роль гаплотипа TNFa -308*A/ -238*G в развитии данного заболева­ния в Колумбии [9]. TNFa-308*A полиморфизм отмечен как протективный против туберкулеза в Си­цилии [10], но не ассоциирован с заболеванием в исследованиях в Турции [11] и Камбодже [12]. По данным мета-анализа, проведенного Z.Zhang et al., не обнаружена ассоциация TNFa-238*G/A с туберкулезом [13].

В исследованиях Selvaraj обнаружено, что варианты -238*А и -308*А сами по себе не только не играют никакой роли в развитии туберкулеза, но даже оказывают протективное действие в сочетании с вариантом гена HLA В*17[14]. Однако автор отмечает, что сочетание соответствующих гаплотипов защищает человека от развития легочного туберкулеза только на первых этапах заболевания. На ста­дии иммунного ответа наличие подобного гаплотипа у пациентов способствует ухудшению состоя­ния и возникновению рецидивов.

До сих пор остается дискуссионным вопрос, находится ли феномен ассоциации с заболеваниями под прямым влиянием SNPs различных генов или связан с включением в этот процесс «функцио­нально молчащих» генов при условии неравновесного сцепления с аллелями генов HLA системы. Ген TNFa расположен на 6 хромосоме в локусе, внутри кластера генов III класса MHC, между HLA B и HLA DRB1 генами. Известно существование неравновесного сцепления между редким аллелем — 308*А TNFa и DRB1*03 [14]. Небольшое число исследований посвящено комплексному изучению возможного сцепления между генами HLAI, II и III классов. Все они указывают на то, что ассоциации вариантов иммунорегуляторных генов с заболеваниями отражают их сцепление с генами HLA. Уста­новлено достоверное неравновесное сцепление между геном HLA DRB1 и полиморфизмом TNFa-308G-A, что свидетельствует о необходимости анализа параметров неравновесного сцепления между TNFa и локусами HLA II, лежащего в основе оценки генетического вклада аллелей и гаплоти-пов гена TNFa в развитие аутоиммунных, инфекционных и мультифакториальных заболеваний [15].

Цель

Необходимо оценить распределение частот встречаемости аллелей, генотипов и гаплотипов SNPs гена TNFa -308 G/A и -238 G/A у больных туберкулезом легких русских Челябинской области.

Материалы и методы

Исследуемую группу составили 86 больных туберкулезом легких русской национальности (29 женщин и 57 мужчин), находящихся на стационарном лечении в ГУЗ «Противотуберкулезный диспансер № 3» г. Челябинска. Согласно российской клинической классификации, выделены сле­дующие группы больных: больные с фиброзно-кавернозным туберкулезом — 11, с инфильтратив-ным — 53, очаговым — 13, цирротическим — 1, туберкулемой — 3, экссудативным плевритом — 2, с диссеминированным туберкулезом — 3 (Приказ МЗ РФ от 21.03.2003 № 109). Бактериовыделение зафиксировано у 73 % больных. Группу сравнения составили 85 практически здоровых лиц русской популяции (36 женщин и 49 мужчин). Группы имели одинаковый социоэкономический статус.

Типирование SNPs в гене TNFa проводилось методом ПДРФ с эндонуклеазой рестрикции NcoI (-308G-A) и BamHI(-238G-A)[16]. Последовательности праймеров для определения SNPs в генах -308 G/ATNFa и -238 G/ATNFa синтезированы в ООО «Синтол». Реакционная смесь «GenePak^TMCore» для постановки ПЦР-реакции синтезировалась в ООО «Лаборатория ИзоГен», г. Москва. ПЦР-амплифи-кация проводилась на приборе «Терцик» (производитель НПФ «ДНК-Технология»). Детекция ре­зультатов — электрофорез в 8 %-ном акриламидном геле, гель-документирование.

Для статистической обработки использовались стандартные генетические методы: расчет непа­раметрического критерия %², с поправкой Йетса для двух групп сравнения. При абсолютных значени­ях меньше 5 использовали точный двухсторонний критерий Фишера. Расчет непараметрического критерия X² для 2 степеней свободы. Расчет отношения шансов (OR) с 95 %-ным доверительным ин­тервалом. Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р < 0,05, незначимыми при р > 0,10; для промежуточных значений р (0,05 <р < 0,10) обсуждали тенденцию к различиям. 

Расчет частот гаплотипов проводился методом максимального правдоподобия с помощью компью­терной программы Arlequin 3.1(http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3/).

Результаты

Результаты типирования SNPs в гене TNFa представлены в таблице.

При сравнительном анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма гена TNFa в положении -308 достоверные различия не были обнаружены. На уровне тенденции у больных туберкулезом легких повышена частота аллеля A и генотипа G/A.Также на уровне тенденции сниже­на частота аллеля G у больных по сравнению со здоровым контролем, что привело к снижению час­тоты генотипа G/G. Для TNFa-308 в ряде работ отмечены накопление «высокопродуктивного» аллеля TNFa-308*A в европеоидных популяциях и низкая частота в монголоидных популяциях. Данный по­лиморфизм лежит в регионе HLAIII и находится в неравновесном сцеплении с каким-то другим функциональным полиморфизмом, который непосредственно оказывает влияние на продукцию TNFa, либо в пределах гена TNFa, либо иного гена в пределах HLA.

Несмотря на то, что по данным нашего исследования данный полиморфизм гена TNFa не влияет на предрасположенность к развитию клинической формы туберкулеза, он находится в неравновесном сцеплении с генами HLADRB1. Ранее нами выявлены достоверные отличия в распределении гапло-типа DRB1*03 — TNFa-308*A: у больных туберкулезом данный гаплотип встречается достоверно чаще по сравнению с контролем [17]. Наличие в генотипе пациента гаплотипа DRB1*03 — TNFa-308*A позволяет прогнозировать высокий риск развития туберкулеза легких. Большинство больных с геном DRB1*03 в фенотипе имели ассоциацию с аллелем TNFa-308*A, который связан с повышен­ной продукцией фактора некроза опухолей, а значит с более тяжелым течением заболевания [5]. Час­тота данного гаплотипа повышена у больных с фиброзно-кавернозной формой туберкулеза.

Ранее нами установлено также неравновесное сцепление низкопродуцирующего аллеля TNFa-308*G с геном DRB1*16 [8], который является геном предрасположенности к туберкулезу [18]. У больных туберкулезом по сравнению со здоровым контролем достоверно повышена частота встре­чаемости гаплотипа DRB1*16-TNFa-308*G.Таким образом, у больных туберкулезом аллель DRB1*16 ассоциирован с низкопродуцирующим аллелем TNF-308*G. Известно, что низкая продукция TNFa на начальных этапах заболевания ведет к сниженной активации макрофагов и способствует распростра­нению инфекционного процесса вместо ограничения и образования гранулемы.

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма гена TNFa в положении -238 выявил достоверное повышение частоты гетерозиготного генотипа G/A(18,60 % и 7,06 %, X² = 4,11, р = 0,043) и аллеля А (9,30 % и 3,53 %, X² = 3,81, р = 0,050) у больных по сравнению с контролем. По некоторым источникам аллельTNFa-238*A связан с пониженной продукцией цито-кина [4]. Кроме того, обнаружено достоверное понижение гомозиготного генотипа G/G (81,40 % и 92,94 %, X² = 5,08, р = 0,024) и аллеля G (90,70 % и 96,47 %, X² = 4,73, р = 0,029) у больных по сравне­нию с контролем.

Распределение аллелей и генотипов SNPs в генах -238TNFa и -308TNFa у больных туберкулезом легких и здоровых лиц русской популяции. У женщин, больных туберкулезом выше частота встречаемости низкокопродуцирующего аллеля TNFa-238*A (10,34 % и 1,39 %, X² = 5,06, р критерий Фишера = 0,044, OR = 8,192 и 95 % CI 1,009^69,679) и гетерозиготного генотипа G/A (20,7 % и 2,8 %, X² = 5,36, р критерий Фише­ра = 0,0388, OR = 9,130 и 95 % CI 1,031^80,357), чем у здоровых. У мужчин различий в распределе­нии TNFa не обнаружено.

На следующем этапе мы рассмотрели гаплотипы TNFa -380G/A / -238G/A.

Сравнительный анализ распределения частот гаплотипов гена TNFa -308/ -238 показал, что у больных туберкулезом по сравнению со здоровым контролем достоверно повышена частота встре­чаемости гаплотипа -308*G/ -238*A (0,093 и 0,027 соответственно, X² = 4,73, р = 0,030, OR = 2,80), отвечающего за низкую продукцию TNFa. Наши данные согласуются с данными литературы в том, что содержание TNFa у больных туберкулезом легких имеет тенденцию к снижению [19].

Низкая продукция TNF альфа у носителей аллеля TNFa -238*A, генотипа TNFa-238*G/A и гап-лотипа TNFa-308*G/ -238*A, вероятно, ведет к нарушению иммунного ответа: не происходит кисло­родного взрыва, снижается активация макрофагов и не происходит образование гранулемы. Все это способствует распространению инфекции и прогрессированию туберкулезного процесса. Таким об­разом, данные полиморфизмы гена TNFa являются предрасполагающими к развитию клинических форм туберкулеза легких.

У больных туберкулезом легких достоверно снижена частота гомозиготного гаплотипа TNFa-308*G/-238*G (0,727 и 0,843, X² = 5,88, р = 0,015, OR = 0,52). Гаплотип TNFa-308*A/-238*A обнару­жен не был, что соответствует литературным данным [20].

Таким образом, в нашей работе показаны особенности распределения частот SNPs TNFa у боль­ных туберкулезом легких русской популяции. Установлена ассоциация туберкулеза с генотипами, содержащими низкопродуктивные аллели и гаплотипы TNFa. Можно предположить, что для боль­ных с клиническими формами туберкулеза легких, представителей русской популяции Челябинской области, характерна тенденция к снижению продукции TNFa, что препятствует процессу ограниче­ния очага воспаления и способствует распространению инфекционного процесса и развитию некро­зов.

Вариабельность результатов иммуногенетических исследований может быть связана как с гене­тической гетерогенностью исследованных популяций, так и с патофизиологическими особенностями в патогенезе туберкулеза легких у представителей разных этнических групп. По всей видимости, в процессе расо- и этногенеза частоты аллелей и генотипов приобрели свою специфику у разных на­родов и это, в свою очередь, могло внести определенный вклад в наследственную компоненту диф­ференциальной подверженности туберкулезу в разных популяциях. Кроме того, важной проблемой низкой результативности картирования генов предрасположенности к туберкулезу является уникаль­ность индивидуальных сочетаний аллелей генов предрасположенности, формирующих риск заболе­вания различных популяций, недостаточный объем исследуемых выборок, что не позволяет оценить комплексный характер взаимодействия генов и их конкретную роль в детерминации полигенной предрасположенности к туберкулезу. Несмотря на очевидную практическую значимость, перечис­ленные выше вопросы недостаточно освещены в литературе. Крайне актуальной является комплекс­ная оценка вовлеченности различных полиморфных вариантов генов-кандидатов в формирование туберкулеза в различных популяциях мира.

Вывод

Для пациентов с клиническими формами туберкулеза легких, европеоидов Челябинской области, характерно следующее распределение частот SNPs гена TNFa: повышена частота встречаемости ал-леля TNFa-238*A, генотипа TNFa-238*G/A и гаплотипа TNFa-308*G/-238*A.

Список литературы

1. Walzl G., Ronacher K., Hanekom W. Immunological biomarkers of tuberculosis // Natura Rev. Immunology. — 2011. — 11, No. 5. — P. 343-354.
2. Engele M., Stossel E., Castiglione K. et al. Induction of TNF in human alveolar macrophages as a potential evasion mecha­nism of virulent Mycobacterium tuberculosis // The Journal of Immunology. — 2002. —168. — P. 1328-1337.
3. Супотницкий М.В. Эволюционная патология. К вопросу о месте ВИЧ-инфекции и ВИЧ/СПИД-пандемии среди дру­гих инфекционных, эпидемических и пандемических процессов. — М., 2009. — 400 с.
4. С.В.Беляева, А.Л.Бурмистрова и др.
5. Никулина Е.Л., Наследникова И.О., Сухаленцева Н.А. и др. Функциональный полиморфизм геновIL10 иTNFa при туберкулезе легких // Науки о человеке: Сб. ст. по материаламXII Рос. конгресса молодых ученых с междунар. участием / Под ред. Л.М.Огородовой, Л.В.Капилевича. — Томск, 2011. — С. 104.
6. Рыдловская А.В., Симбирцев А.С. Функциональный полиморфизм генаTNFa и патология // Цитокины и воспаление.— Т. 4, № 3. — С. 4-10.
7. Wilson A.G., Symons J.A., Grall F. et al. Effect of a polymorphisms in the human tumor necrosis factor a on transcriptional activation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1997. — 94. — P. 3195-3199.
8. Бикмаева А.Р., Сибиряк С.В., Хуснутдинова Е.К. и др. Полиморфизм гена фактора некроза опухолей альфа у боль­ных инфильтративным туберкулезом легких в Башкирии // Молекулярная биология. — 2002. — Т. 36, № — С. 784-787.
9. Wang Q., Zhan P., Qiu T.X. et al. TNF-308 gene polymorphism and tuberculosis susceptibility: a meta-analysis involving 18 studies // Molecular Biology Reports. — 2012. — 39, No. 4. — P. 3393-4000.
10. Correa P., Gomez T., Cadena J. et al. Autoimmunity and tuberculosis. Opposite association with TNF polymorphism // The Journal of Rheumatology. — 2005. — 32. — P. 219-224.
11. Scola T., Crivello A., Marino V. et al. IL-10 and TNF-alpha polymorphisms in a sample of Sicilian patients affected by tuber­culosis: implication for ageing and life span expectancy // Mechanisms of Ageing and Development. — 2003. — Vol. 124, No. 4. —569-572.
12. Oral H.B., Budak F., UzaslanK. et al. Interleukin-10 (IL-10) gene polymorphism as a potential host susceptibility factor in tuberculosis // Cytokine. — 2006. — Vol. 35. — P. 143-147.
13. Delgado J.C., Baena A., Thim S. et al. Ethnic-specific genetic associations with pulmonary tuberculosis // The Journal of In­fectious Diseases. — 2002. — 186. — P. 1463-1468.
14. Zhang Z., Zhu H., Pu X. et al. Association between tumor necrosis factor alpha-238G/a polymorphism and tuberculosis sus­ceptibility: a meta-analysis study // BMC Infectious Diseases. — 2012. — Vol. 12. — P. 328.
15. Selvaraj P., Sriram U., Mathan Kurian S. et al. Tumour necrosis factor alpha (-238 and -308) and beta gene polymorphisms in pulmonary tuberculosis: haplotype analysis with HLA-A, B and DR genes // Tuberculosis (Edinb). — 2001. — Vol. 815, No. 6.
16. 335-341.
17. Коненков В.И. и др. Полиморфизм генаTNFA и неравновесное сцеплениеTNFa иHLA-геновII класса (DRB1, DQA1 иDQB1) в популяции сибирских европеоидов // Иммунология. — 2008. — Т. 29, № 1. — С. 6-10.
18. Сташкевич Д.С., Бурмистрова А.Л., Хромова Е.Б. и др. Анализ двухлокусных гаплотиповHLADRB1-TNFa у боль­ных ревматоидным артритом русской популяции // Российский аллергологический журнал. — 2010. — № 14, Вып. 1. — С. 31-32.
19. Тимофеева С.В., Сташкевич Д.С., Суслова Т.А. и др. Распределение двухлокусных гаплотиповHLA-DRB1-TNFa(-308) у больных туберкулезом легких // Вестн. Уральской мед. академич. науки. — 2012. — Т. 4, № 41. — С. 247, 248.
20. Тимофеева С.В., Бурмистрова А.Л., Суслова Т.А. и др. ПолиморфизмHLAII у больных туберкулезом легких русской популяции челябинской области // Вестн. Уральской мед. академич. науки. — М., 2011. — Т. 2. — С. 117-118.
21. Tio D.A., Candore G., Colombo A. et al. Genetically Determined High Setting of TNF-a Influences Immunologic Parameters of HLA-B8, DR3 Positive Subjects: Implications for Autoimmunity // Human Immunology. — 2001. — 62. — P. 705-713.
22. Kettaneh A., Seng T., Tiev K.P. et al. Human leukocyte antigens and susceptibility to tuberculosis: a meta-analysis of case-control studies // The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. — 2006. — 10, No. 7. — P. 717-725.