Отбор штаммов рода Bacillus с противогрибковой активностью для создания эффективных биопрепаратов

Ежегодный ущерб, наносимый вредителями и болезнями сельскохозяйственным культурам, по данным организации по продовольствию и сельскому хозяйству ООН, составляет примерно 20-25 % потенциального мирового урожая продовольственных культур. Поэтому роль защиты растений в увеличении производства и сохранении сельхозпродуктов огромна [1]. В северном регионе — основ­ной житнице республики — чрезвычайную опасность для яровой пшеницы представляют корневая гниль, бурая ржавчина и септориоз, которые проявляются почти ежегодно и в зависимости от при­родных условий года и других факторов распространяются на площади до 3-5 млн. га, потери урожая достигают 15-20 % и более [2]. Основной урон сельскому хозяйству наносят фитопатогенные грибы родов Fusarium, Bipolaris, Penicillum и др., являющиеся возбудителями различных гнилей, пятнистостей, увядания, скручивания листьев и других заболеваний растений. Биологический контроль фито-патогенов in vitro является до сих пор одним из основных критериев отбора практически полезных штаммов. Для селекции бактерий-антагонистов против возбудителей наиболее распространенных болезней зерновых и овощных культур были выделены изоляты спорообразующих микроорганизмов.

Анализ тенденции развития в области защиты растений в России, США и других странах пока­зал, что против фитопатогенных организмов определенную перспективу имеет применение биологи­ческого метода, в частности, микроорганизмов-антагонистов и индустрированной устойчивости рас­тений. Ученые многих стран мира отдают предпочтение использованию биологических препаратов бактериального происхождения [3]. Так, в связи с биологизацией и экологизацией сельскохозяйственно­го производства направление по созданию биопрепаратов для защиты растений становится все более акту­альным. Существует множество биологических функций микроорганизмов, направленных на осуществле­ние биосинтеза метаболитов различного действия. Потенциальным объектом агробиотехнологии являются ризосферные PGPR (от Plant Growth-Promotion Rhizobacteria), широко используемые для разработки био­логических средств защиты растений от фитопатогенов, а также биопрепаратов, стимулирующих рост и повышающих продуктивность растений [4].

Механизм действия этих микроорганизмов на фитопатогены включает конкуренцию за источник питания, эффективную колонизацию ризосферы, синтез антибиотических и росторегулирующих ве­ществ [5, 6]. Так, использование микробных культур на основе микроорганизмов-антагонистов фито-патогенов позволяет не только надежно контролировать развитие бактериальных и грибных инфек­ций в течение всего вегетационного периода, но и во время хранения сельскохозяйственной продук­ции или посевного материала [7].

Известно, что 60-90 % живой биомассы почвы составляют микроорганизмы, физиолого-биохимическая активность которых в 100-1000 раз выше, чем макроорганизмов. Почвенные микроор­ганизмы-антагонисты способны подавлять развитие фитопатогенных микромицетов, в том числе и фузариев, за счет секреции в среду экзометаболитов с выраженной антибиотической активностью, а также ферментативного разрушения гифов грибов и жесткой конкуренции за жизненное пространст­во и питательный субстрат. Использование бактерий рода Bacillus как биоагентов микробных препа­ратов имеет ряд преимуществ: данные микроорганизмы легко культивируются, могут длительное время храниться, а также использоваться в виде спор, что облегчает инокуляцию посевного материа­ла и пролонгирует длительность действия биопрепарата в природной среде [8]. Российские ученые уделяют большое внимание использованию для биологической защиты растений бактерий из родов Pseudomonasи Bacillus [9].

Отечественных разработок по созданию биологических фунгицидов очень мало, поэтому данная проблема для нас представляет огромный интерес, так как Казахстан полностью зависит от ввозимых иностранных пестицидов и биофунгицидов.

Материалы и методы

Отбор антагонистов фитопатогенов проводили методом диффузии в агар с применением агаро­вых блоков. Суспензию тест-культуры фитопатогена вносили в расплавленный агар и разливали его в чашки Петри. Пробочным сверлом (диаметр 6-8 мм), предварительно опущенным в спирт и обож­женным в пламени горелки, вырезают 4 агаровых блока. На поверхность агара после застывания по­мещали агаровые блоки, вырезанные с питательной средой СПА, где можно культивировать бакте­рии-антагонисты. После агаровые блоки засевали исследуемыми культурами. Чашки с агаровыми блоками инкубировали 7 суток при температуре 30 0С. Суспензию тест-культуры фитопатогена вно­сили в среду из расчета 10 мл на 100 мл питательной среды.

Результаты и их обсуждение

Биологический контроль фитопатогенов in vitro является до сих пор одним из основных крите­риев отбора практически полезных штаммов. Для селекции бактерий-антагонистов против возбуди­телей наиболее распространенных болезней зерновых и овощных культур были выделены изоляты спорообразующих микроорганизмов.

Целью нашей работы являлось изучение противогрибковой активности бактерий рода Bacillus для создания в дальнейшем на их основе эффективных биопрепаратов. Проведена проверка выделен­ных изолятов спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus на антагонистическую активность против фитопатогенных грибов в условиях in vitro.

Нами были взяты на проверку антагонистической активности 10 штаммов рода Bacillus, выде­ленных из почв Акмолинской области спорообразующих микроорганизмов. В качестве тест-объектов при определении антагонистического спектра бактерий использовали штаммы грибов Fusarium oxysporum 91, Fusarium heterosporum 84 и Alternaria alternata А8, взятых из коллекции Казахского агротехнического университета им. С.Сейфуллина, кафедры агрохимии и почвоведения. Данные гри­бы являются возбудителями наиболее распространенных болезней растений.

Особенности воздействия метаболитов бактерий группы Bacillus на развитие мицелия проявля­лись в следующем. Вокруг колоний бактерий группы Bacillus формируется округлая, четко выражен­ная зона подавления роста мицелия гриба. На границе зоны подавления роста гриба и колонии бакте­рий сформировался ободок, чуть приподнятый над средой.

Результаты микроскопирования мицелиальной клетки гриба A.Alternata А8 представлены на ри­сунках 1 и 2. При микроскопировании подавленного мицелия просматриваются морфологические изменения клеток мицелия. Они заметно округляются, укорачиваются в гифах, наблюдается грануля­ция цитоплазмы, происходит образование хламидоспор, на концах конидий образуются пузыревид­ные вздутия (рис. 2).

Мицелий гриба А alternata А8

Показатели антагонистической активности выделенных штаммов бактерий рода Bacillus по от­ношению к фитопатогенным грибам приведены в таблице 1.

Антагонистическая активность бактерий рода Bacillus по отношению к фитопатогенным грибам

Как показывают данные таблицы 1, в результате антагонистического действия бактерий рода Bacillus на фитопатогенные грибы вокруг колоний бактерий наблюдается отсутствие зоны роста гри­ба. Наиболее сильными антагонистическими свойствами по отношению к F. heterosporum 84 облада­ли бактерии Bacillus шт. 2, Bacillus шт. 31, Bacillus шт. 9, Bacillus шт. 18. Диаметр зон подавления роста гриба колебался в пределах от 21 до 41 мм. Диаметр в пределах 3-14 мм отмечен у 6 испытуе­мых штаммов бактерий по отношению к F. heterosporum 84. Активность против гриба F. oxysporum 91 проявили бактерии Bacillus шт. 31, Bacillus шт. 2, Bacillus шт. 9, Bacillus шт. 29, зона подавления мицелия колебалась в пределах 18-45 мм. Активность против гриба A.Alternate А8 проявили бактерии Bacillus шт. 31, Bacillus шт. 2, Bacillus шт. 9, Bacillus шт. 29, Bacillus шт. 18, зона подавления мицелия колебалась в пределах от 18 до 38 мм. По тестированию фунгицидной активности штаммов бактерий было выявлено, что все штаммы давали четко выраженную границу между бактериальной и грибной культурами.

В результате проведенных экспериментов были отобраны 3 активных штамма микроорганизмов (Bacillus шт. 31, Bacillus шт. 2, Bacillus шт. 9) с наибольшей антифунгальной активностью по отноше­нию к фитопатогенным грибам и на их основе наработана культуральная жидкость. Диаметр зон по­давления роста гриба F. oxysporum 91 колебался в пределах от 23,3 до 45 мм. Диаметр в пределах 21,7-41,7 мм отмечен у отобранных штаммов бактерий по отношению к F. heterosporum 84. Актив­ность против гриба A. alternata А8, зона подавления мицелия колебалась в пределах 25 до 36,7 мм.

Далее нами был поставлен повторный опыт по отношению к фитопатогенам. Результаты иссле­дования показаны на рисунках 3 и 4.

Антагонистическая активность бактерий рода Bacillus subtilis шт.2 по отношению к F. heterosporum 84

Антагонизм штаммов бактерий группы Bacillus шт. 31и Bacillus шт. 9 по отношению к A.alternata A8

При изучении штамма Bacillus шт. 2 выявлено, что он обладает наиболее сильным антибиотиче­ским действием по отношению ко всем исследуемым фитопатогенным грибам. Сильно выраженный антагонизм он проявил особенно в отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium oxysporum 91, где прозрачная зона достигла 46,0 мм, эффективность подавления роста гриба F. heterosporum 84 также была высокой — 42,0 мм. В отношении остального фитопатогена — AAlternatci А8 проявил среднюю степень антагонизма. Средний радиус зоны лизиса данного штамма составляет 41,5 мм. Из числа исследуемых тест-культур штамм Bacillus шт. 9 проявлял ярко выраженное антагонистическое действие только по отношению к двум фитопатогенам — зона подавления A. alternata А8 и F. oxysporum 91 составляет от 36,7 до 33,3 мм. При изучении антибиотического действия штамма Ba­cillus sp. 31 установлено, что он ингибирует развитие всех изучаемых фитопатогенных грибов. При подсеве фитопатогенов отмечен рост штамма в виде волнообразного полукруга и в радиусе 28,3 мм для гриба A.Alternata А8, 30,0 мм — для гриба F. oxysporum 91, 39,7 мм — для гриба F. heterosporum 84.

Отобранные активные штаммы-антагонисты были идентифицированы генно-молекулярными, а также классическими методами исследования. На основании изученных методов штамм Bacil­lus sp. 31 отнесен к виду Bacillus cereus, штамм Bacillus sp. 2 — к виду Bacillus subtilis, штамм Bacillus sp. 9 — к виду Bacillus cereus.

Выводы

В настоящее время перспективным направлением является разработка безопасных и эффектив­ных биологических средств борьбы с патогенными грибами и микроорганизмами, которая предпола­гает широкое применение препаратов на основе бактерий-антагонистов и их метаболитов, прояв­ляющих активность против широкого спектра грибных патогенов. Наибольшей антифунгальной ак­тивностью из всех исследованных штаммов по отношению к фитопатогенным грибам обладали штаммы бактерий Bacillus subtilis 2, Bacillus cereus 31 и Bacillus cereus 9.

В заключение можно сказать, что отбор активных штаммов позволит рекомендовать бактерии-антагонистов для создания на их основе высокоэффективных экологически безопасных препаратов защиты растений от заболеваний, вызываемых патогенными грибами.

 

Список литературы

  1. Газета «Казах Зерно.kz» — № 5 (5). 20 июля.
  2. Койшибаев М., Пономарева Л.А. Вредоносность болезней яровой пшеницы с воздушно-капельной инфекцией в Север­ном Казахстане // Вестн. сельхоз. науки Казахстана. — 2008. — № 8. — С. 15-19.
  3. Morgounov A., Rosseva L. and Koyshibayev M. Leaf rust Wheat in Northern Kаzakhstan and Siberia incidence virulence and breeding for resistance // Australian Journal of Agricultural Research. — 2007. — № 56. — Р. 847-853.
  4. Maurhofer M., Keel C., Schider C. et al. Disease control and pest management, Influence of enhanced antibiotic production in Pseudomonasfluorecens strains CHAO on its disease suprossive capacity // Phythopatology. — 1992. — № 82. — 190-195.
  5. Pfender W.F., Kraus J. and Loper J.E. Agenomic region from Pseudomonas fluorecens Pf-5 required for pirrolnitrinpriduction and inhibition ot Pyrenophora tTitici-repentis in wheat straw // Phythopatology. — 1993. — № 83. — 1223-1228.
  6. Надыкта В.Д. Перспективы биологической защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов // Защита и каран­тин растений. — 2004. — № 6. — С. 26-28.
  7. Воронин А.М., Кочетков В.В. Биологические препараты на основе псевдомонад // АГРО XXI. — 2000. — 140 с.
  8. Benizri E., Baudon E., Guckert A. Root colonization by inoculated plant growth-promoting rhizobacteria // Biocontrol science and technology. — 2001. — № 11. — 557-574.
  9. ШтерншисМ.В., Джалилов Ф.С., АндрееваИ.В. и др. Биопрепараты в защите растений. — Новосибирск, 2000. — 128 с.
  10. Кузин А.И., Кириченко П.М., Кузнецова Н.И. и др. Фунгицидные свойства штаммаBacillussubtilis// Сельскохозяйст­венная микробиология вXVIII-XIX веках: Материалы Всерос. конф. — СПб., 2001. — С. 30.
Фамилия автора: Ботбаева Ж.Т., Мустафина И.Е., Аюпова А.Ж., Науанова А.П., Жамангара А.К.
Год: 2011
Город: Караганда
Категория: Биология
Яндекс.Метрика