Фитохимическое изучение Thalictrum Foetidum L. (Василистник вонючий)

Проведено фитохимическое изучение надземной части Василистника вонючего (Thalictrum foetidum L), собранного в Каркаралинском районе Карагандинской области. Сумма алкалоидов из растительного сырья извлекается методом хлороформной экстракции. Для выделения индивидуальных соединений применен метод колоночной хроматграфии и обработка суммы экстрактивных веществ. На основе апорфиного алкалоида глауцина получены новые производные глауцина. Структуры новых производ­ных алкалоидов идентифицированы с привлечением современных физико-химических методов УФ-, ИК- ЯМР 1Н, ЯМР 13С-спектроскопии. 

Виды рода Ihalictrum L. (Василистник) семейства Ranunculaceae (Лютиковые) характеризуются высоким содержанием алкалоидов изохинолинового ряда, обладающих противокашлевым, противо­воспалительным, гипотенизивным, антинаркотическим, антиаритмическим, желчегонным и другими фармакологическими свойствами [1].

Василистник вонючий встречается в Каркаралинском районе, Тарбагатае, Джунгарском Алатау, Заилийском, Кунгей-Алатау, Кетмень, Терскей-Алатау, Киргизском Алатау, Восточном мелкосопоч-нике [2].

Настойка надземной части Василистника вонючего (Thalictrum foetidum L.) применяется в науч­ной медицине в качестве гипотензивного средства при гипертонической болезни I и II стадии [3].

В народной медицине находят применение и другие виды этого рода, в частности, Василистник желтый, Василистник малый и др. Лекарственное значение имеет надземная часть — трава растения. Она содержит 1 % флавоноидов, 0,7 — алкалоидов, до 6,5 — сапонинов и дубильных веществ — до 2 %. В народной медицине применяют также корни и корневища василистника.

Из-за содержания алкалоида фетидина растение имеет гипотензивное действие. В медицинской практике настойку из василистника на 70 °-ном спирте применяют на начальных стадиях гипертони­ческой болезни. Как правило, ее назначают 2-3 раза в день по 15-20 капель. Помимо этого, настойка положительно воздействует на больных стенокардией. Часто в народной медицине василистник употребляют как успокаивающее средство при неврозах и судорожных состояниях, а также при расстройстве органов пищеварения, заболеваниях желчного пузыря и печени, как кровоостанавли­вающее средство при наружных и внутренних кровотечениях (легочных, носовых, маточных и др.)[4, 5].

С учетом этого нами было проведено фитохимическое изучение надземной части Василистника вонючего, собранного в Каркаралинском районе Карагандинской области.

В результате проведенных исследований из надземной части Василистника вонючего нами было выделено кристаллическое вещество с т.пл., 115-117 ^оС. В ИК-спектре данного соединения имеются полосы поглощения в области 2800, 1600, 1583, 1440 и 1318 см^-1, характерные для метильных групп, ароматических колец и метиленовых фрагментов.

В ПМР-спектре вещества проявляются сигналы протонов четырех метоксильных групп в виде синглета при 3.59 (3Н) и 3.86 м.д. (9Н, 3 х ОСН₃), а также синглет а при 2.89 м.д. (3Н, N-QT₃). В об­ласти ароматических протонов Н-3, Н-8, Н-11 наблюдаются синглеты при 6.56, 6.78 и 8.03 м.д.

На основании физико-химических констант, данных ИК-, ПМР-спектров и сравнения литературных данных [6] выделенное вещество идентифицировали как апорфиновый алкалоид глауцина (1).

Глауцин, типичный представитель апорфиновых алкалоидов, встречающихся в ряде растений рода Thalictrum L. (Василистник) и Glaucium L. (Мачок), является действующим началом противо-кашлевых средств [7]. Глауцин — один из важных и доступных алкалоидов апорфинового ряда. Не­смотря на это химическая модификация глауцина до последнего времени практически не исследова­лась.

Нами рассмотрено взаимодействие глауцина с ацетатом ртути, бромистоводородной и йодисто-водородной кислотами, галоидными алкилами, уксусным ангидридом и бромом в обычно применяе­мых условиях.

Установлено, что взаимодействие глауцина с ацетатом ртути в присутствии NBH₄ протекает при комнатной температуре и приводит к удовлетворительному выходу соединения (2).

В ИК-спектре соединения (2) имеются полосы поглощения в области 2924, 1613, 1720 и 1462 см^-1, характерные для метильных групп, ароматических колец и метиленовых фрагментов.

В ПМР-спектре (2) проявляются сигналы протонов четырех метоксильных групп при 3.85, 3.89, 3.90 и 3.94 м.д. (3Н), а также N-GrI₃ при 2.99 м.д. в виде синглета. Метиленовые группы в положени­ях 4 и 5 дают два триплета при 3.20 и 3.27 м.д (по 2Н, 1=6Гц). В области ароматических протонов Н-3, Н-8, Н-11 наблюдаются однопротонные синглеты при 6.61- 7.0 и 9.00 м.д.

Для установления пространственного строения соединения (2) проведено его рентгеноструктур-ное исследование.

Длины связей и валентные углы близки к обычным, за исключением наличия двойной связи С6=С7, которая равна 1,355 А. Цикл С1С2С3С5С14С13 плоский, с точностью ± 0,0028 А. Пипериди-новый цикл С4С5ЩС6С14С15 принимает конформацию почти идеальной софы (АС _s ⁵ = 1.46^о) с вы­ходом атома С5 из средней плоскости остальных атомов цикла на 0.64 А. В молекуле (2) метилодида 7-гидроксиглауцина. Цикл С16С8С9С10С11С12 плоский, с точностью ± 0,015 А. Все метоксигруппы лежат в плоскости ароматических ядер, за исключением метоксигруппы при атоме С1, которая раз­вернута перпендикулярно плоскости цикла (торсионный угол С2С101 С17=81,67^о).

Таким образом, методом РСА однозначно установлена кристаллическая и молекулярная струк­тура нового производного глауцина, которая имеет строение 6,7-дегидроглауцина (2).

При нагревании глауцина с HBr и HI до 60-70 ^оС в хлороформе происходит селективное расще­пление эфирных связей и образование производного глауцина (3).

ИК-спектр (3) имеет широкую полосу поглощения в области 3300-3600 см^-1, характерную для ОН-групп с внутримолекулярными водородными связями, и полосы в области 2899, 2829, 1598 и 1464 см^-1, свойственные метильным группам, ароматическим кольцам и метиленовым фрагментам.

Реакции глауцина с CH3I и C2H5I в присутствии К2СО3 приводят к четвертичным аммониевым солям (4,5).

ИК-спектры солей имеют полосы поглощения в области 2930,1600 и 1462 см^-1, характерные со­ответственно для метильных групп, ароматических колец и метиленовых фрагментов.

В ПМР-спектре (4) проявляются сигналы протонов четырех метоксильных групп при 3.72, 3.87, 3.93 и 3.94 м.д. (3Н), а также N-метильных групп при 3.13 и 3.50 м.д. в виде синглета. В области арома­тических протонов Н-3, Н-8, Н-11 наблюдаются однопротонные синглеты при 6.93- 7.06 и 8.00 м.д.

Строение молекулы катиона соединения (4) изучено методом рентгеностуктурного анализа.

В связи с разупорядоченностью двух атомов гексадиеновый цикл имеет форму двух зеркально-симметричных полукресел для разупорядоченных частей 1 и 2. В части 1 атомы С (7а) и С (6а 1) вы­ходят в разные стороны из плоскости, в которой лежат остальные атомы гексадиенового кольца (среднеквадратичное отклонение от плоскости 0.013 А), на 0.35 и 0.26 А соответственно; в части 2 атомы С (7а) и С (6а2) отклоняются на -0.35 и 0.67 А соответственно.

Пиперидиновый цикл в разупорядоченной части 2 имеет форму софы с выходом на 0.77 А атома N (62) (среднеквадратичное отклонение остальных атомов цикла от плоскости 0.012 А). В части 1 конформация пиперидинового цикла имеет форму полукресла с сильным искажением в сторону софы — атомы N (61) и С (51) выходят в разные стороны от плоскости остальных четырех атомов (средне­квадратичное отклонение от плоскости 0.016 А) на 0.20 и -0.49 А. Бензольные кольца плоские и лежат практически в одной плоскости: двугранный угол между ними 5.5 (8)°. Метоксигруппы в 2,9,10-положениях лежат практически в плоскости бензольных колец (т.е. имеют заслоненную конформацию), в 1-положении имеет гош-конформацию: торсионный угол С (2)-С (1)-О (1)-С (12) равен 84.4 (2)"³. Фи­зико-химические константы глауцина и его производных приведены в таблице 1.

Биологическая активность производных алкалоидов глауцина

Была изучена антимикробная активность производных глауцина, для определения которой были использованы штаммы грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillm subtilis и грамот-рицательные штаммы Escherichia coli, Pseudomonas aerugiпоsа, а также дрожжевой гриб Сапdida a1bicans (методом диффузии в агар (лунок)).

Экспериментальная часть

Для колоночной хроматографии использовали прокаленный А1₂О_з (II ст.активности), для ТСХ — пластинки Silufol UV-254 и Silicagel оп А1шшпшп, 20Х, проявитель — пары йода. Температуру плав­ления определяли на приборе Воейпш. ИК-спектры снимали на Фурье-спектрофотометре Vektor-22 в КВг. Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С получены на спектрометрах Вгшкег АС 200 [рабочие частоты 200.13 (¹Н) и 50.32 МГц (¹³С)] и Вгшкег DRX 500 [рабочие частоты 500.13 (¹Н) и 125.76 МГц (¹³С)] для 5 %-ных растворов СDC1₃ или СD₃OD.

Хлороформная экстракция: 800 г надземной части воздушно-сухого сырья смачивали 5 %-ным раствором соды и исчерпывающе экстрагировали хлороформом. Хлороформный экстракт взбалтыва­ли с 5 %-ным раствором серной кислоты. Кислый раствор промывали хлороформом, затем при охла­ждении подщелачивали содой, и алкалоиды экстрагировали хлороформом. Получили 12 г (1,3 %) суммы экстрактивных веществ (от веса воздушно-сухого сырья). При колоночной хроматографии на оксиде алюминия в соотношении сумма: носитель 1:70 с применением в качестве элюента смеси гек-сан-этилацетат выделили 0,03 г алкалоида глауцина. Т.пл. 115-117 °С.

ИК-спектр (КВг v, см^-1): 846, 950, 975, 1005, 1121, 1161, 1200, 1228, 1318, 1392, 1440, 1535, 1595, 1600, 2850, 2930, 2958.

Взаимодействие глауцина с ацетатом ртути

0,1 г глауцина растворяли в 10 мл абсолютного хлороформа. К полученному раствору добавляли 0,012 мл ацетата ртути и 0,009 г боргидрида натрия. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение трех часов. Раствор отфильтровали, фильтрат промыли водой, экстрагировали три раза хлороформом и сушили безводным сульфатом натрия. Растворитель упарили, остаток хроматографи-ровали на колонке с окисью алюминия, элюент — гексан. Получили кристаллическое вещество с т.пл. 120-123 °С, выход 45 %.

ИК-спектр (КВг v, см 614, 806, 846, 950, 1001, 1030, 1085, 1110 (-СН2), 1121, 1161, 1200, 1228, 1259, 1298, 1332, 1392, 1510 (С-Аг), 1590 (С- N), 1637 (С=С), 1758, 2824 (N-OT), 2958 (ОСН3), 3000.

ПМР-спектр (200 МГц, СDС1з, 5, м.д. J/Гц): 3.0 (3Н, с., ^СЩ, 3.35 (2Н, тр., J =6, Н-5), 3.87, 3.96,3.99,4.0 (ЗН, с, ОСН3), 6.79, 6.98, 7.1, 7.23 (1Н, с, Н-3, Н-8, Н-11).

Взаимодействие глауцина с бромистоводородной кислотой

0,1 г (0,23 ммоль) глауцина растворили в абсолютном хлороформе, добавили 0,03 мл (0,22 ммоль) этиленгликолевого эфира борной кислоты. Смесь перемешивали при комнатной темпе­ратуре в течение 10 часов. Осадок отфильтровали, фильтрат упаривали. Получили кристаллическое вещество с т.пл. 236-238 °С, выход 65 %.

ИК-спектр (КВг v, см 842, 955, 1001, 1030, 1080, 1120 (СН), 1210(О-СН,-СН2О), 1260, 1300, 1330, 1377 (СН3), 1515 (С-Аг), 1635 (С=О), 1756, 2820 (Ч-СТ), 2960 (ОСН3).

ПМР-спектр (200 МГц, СDС1з, 5, м.д. J/Гц): 3,09 (3Н, с, N -СН3); 3,20; 3,62; 4,77; 4,80, 4,85 (по 2Н, м., (О-СН2-СН2-О-)2); 3,76; 3,86; 3,88; 3,96 (3Н, с, ОСН3); 6,66; 6,72; 8,03 (1Н, с, Н3, Н8).

Взаимодействие глауцина с галоидными алкилами

100 мг глауцина гидрбромида растворяли в 10 мл этилового спирта. К полученному раствору до­бавляли 0,045 мл свежеперегнанного йодистого алкила (метил, этил) и 0,05 мг поташа. Реакционную смесь нагревали в течение 10 часов, по охлаждении осадок отфильтровали, промыли этанолом, объе­диненные маточные растворы упарили. Остаток растирали с эфиром, выделили алкилиодиды (4,5). Соединение (4) — выход 90 %, т.пл. 223-226 °С. Соединение (5) — выход 45 %, т.пл. 198-200 °С.

Соединение (4) — ИК-спектр (КВг v, см^-1): 790, 892,921,952, 1014, 1038, 1103. 1147, 1171, 1230, 1245, 1269, 1341, 1371, 1397, 1465, 1514, 1579, 1796, 2850, 2940, 2958, 3005, 3500.

ЯМР ¹Н (200 МГц, СDC1з 5, м.д. J/Гц): 3.38 (3Н, с., ^СТ), 1,26 (3Н, с., ^СТСШ, 1.59 (2Н, м, СН₂СН₃), 3.10 (2Н, тр., J=10.5, Н-5), 3.70, 3.88, 3.92, 3.95 (3Н, с.ОСН₃), 6.67, 7.21, 8.02 (1 Н, с, Н-3, Н-8, Н-9).

Соединение (5) — ИК-спектр (КВг v, см^-1): 767, 881, 901, 952, 1004, 1030, 1103, 1147, 1171, 1220, 1245, 1269, 1341, 1371, 1397, 1465, 1514, 1579, 1796, 2850, 2930, 2958, 3005, 3426.

ЯМР ¹Н (200 МГц, СDC1з 5, м.д. J/Гц): 3.13; 3.50 (ЗН, с., ^(СНзТ); 2.99 (2Н, тр., J=13.5, Н-5); 3.80 (1 Н, д., 1=5.0, Н-6); 3.72; 3.87, 3.93, 3.94 (3Н. с. ОСН3), 6.93, 7.06, 8.00 (1Н, с, Н-3, Н-8, Н-9).

Результаты исследований антимикробной активности

Культуры выращивали на жидкой среде (МПБ) рН 7,3 ± 0,2 при температуре от 30 до 35 °С в те­чение 18-20 часов. Культуры разводили 1:1000 в стерильном 0,9 %-ном растворе натрия хлорида изо­тоническом, вносили по 1 мл в чашки с соответствующими элективными питательными средами для изучаемых тест-штаммов и засевали по методу «сплошного газона». После подсушивания на поверх­ности агара формировали лунки размером 6,0 мм, в которые вносили растворы исследуемых образцов и препараты сравнения по 10 мкл. В контроле использовали 96 %-ный этиловый спирт в эквиобъем-ных количествах. Посевы инкубировали при 37 °С, учет растущих культур проводили через 24 часа.

Антимикробная активность образцов оценивалась по диаметру зон задержки роста тест-штаммов (мм). Диаметры зон меньше 10 мм и сплошной рост в чашке оценивали как отсутствие ан­тимикробной активности, 10-15 мм — слабая активность, 15-20 мм — умеренно выраженная актив­ность, свыше 20 мм — выраженная. Каждый образец испытывался в трех параллельных опытах. Ста­тистическую обработку проводили методами параметрической статистики с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки. Результаты исследования антимикробной активности об­разцов приведены в таблице 2.

В результате испытаний установлено, что глауцин обладает выраженной антибактериальной ак­тивностью к штаммам грамположительных бактерий Staphylococcus aurtus и умеренной — к Bacillus subtilis и к грамотрицательным штаммам Escherihia coli, а также к дрожжевому грибу Candida albi-cans.

Метилйодид глауцина обладает высокой антимикробной активностью в отношении Bacillm sub­tilis. В отношении S. aureus и Е. соіі данное вещество проявило умеренно выраженную активность.

Список литературы

1. АриповаХ.Н. Итоги исследования алкалоидоносных растений. — Ташкент: ФАН, 1993. — 220 с.
2. Садритдинов Ф.С., Курмуков А.Г. Фармакология растительных алкалоидов и их применение в медицине. — Ташкент: Медицина, 1980.
3. Wu Yang-Ckang, Lu Sneng-Tek.Цитотоксичные апорфиноидные алкалоиды изThalictrum sessile// P — 1988. — № 27. — Р. 1563-1564.
4. , Sticher О., SteineggerE. Phannakognosie-Phytophannazie, Springer — Beriin: Veriag, 1999. — Р. 540.
5. ПолингЛ., ПолингП. Химия. — М.: Мир, 1978. — 164 с.
6. Юнусов С., Прогрессов Н.Н. Об алкалоидахThalictrum minus L.// Журнал органической химии. — 1957. — Т. 22. — № 4. — С. 1047-1055.
7. Машковский М.Д. Лекарственные средства. — М.: Новая волна, 1996. — 235 с.