Генотипирование лекарственного растения Codonopsis clematidea (Shrenk) dark, произрастающего на территории Юго-Восточного Казахстана

Семейство Campanulaceae Juss. распространено во всем мире и включает большое количество известных лекарственных растений, таких как Platycodon grandiflorum, Codonopsis pilosula и Adeno-phora triphylla. По одним данным это семейство состоит из 50 родов и 800 видов [1-2], а согласно другим источникам — из 40 родов и 600 видов [3] или же из 87 родов и 1950 видов [4]. Такое значи­тельное разногласие среди литературных данных связано с несоответствием всех предыдущих клас­сификаций семейства Campanulaceae Juss. Более того, нет общего мнения о границе рода, а также в более высших рангах среди главных субразделов семейства. Таксономические проблемы данного се­мейства могут быть объяснены тем фактом, что все эти ранние классификации имеют более геогра­фическую, чем биологическую основу [5].

Виды семейства Campanulaceae Juss., несмотря на их количество и значение во флоре с умерен­ным климатом, остаются недостаточно изученными [5]. В Казахстане насчитывается 20 видов расте­ний из этого семейства [6].

Одними из перспективных растений этого семейства являются растения рода Кодонопсис (Co-donopsis Wall.). Во флоре СССР [7] указывается, что виды Кодонопсиса произрастают на Дальнем Востоке и в горах Центральной Азии. В Казахстане единственным представителем данного рода является Кодонопсис ломоносовидный (C. clematidea (Shrenk) Clark), произрастающий в горах Тянь-Шаня, Памир-Алае и Джунгарском Алатау [8].

Некоторые виды Кодонопсиса издревле используются в народной медицине, например, C. clematidea — азиатский колокольчик «tang-sheng» [3] или корень «Dangshen» [9] в китайской ме­дицине известен как заменитель дорогостоящего корня женьшеня (Panax ginseng) и до сих пор при­меняется в Китае, Японии и Корее при повышенном кровяном давлении, заболеваниях сердца, при быстрой утомляемости, для укрепления иммунной системы, снижения артериального давления и улучшения аппетита. Благодаря широкому изучению химического состава корнеплодов Кодонопсиса выявлены новые алкалоидные и флавоноидные соединения, тритерпеноиды, сапонины и полиацети­леновые вещества [9-10]. Кроме того, в традиционной медицине Узбекистана при лечении болезней печени используется и надземная часть растений C. clematidea [11]. Алкалоиды кодонопсин и кодо-нопсинин, выделенные из растений C. Clematidea, являются низкотоксичными соединениями и обла­дают широким спектром фармакологического действия, желчегонный эффект которых в два раза выше, чем у часто используемых в медицине берберина и флавина. В настоящее время большое ко­личество препаратов, основанных на кодонопсине, применяется для профилактики и лечения болез­ней печени и желчного пузыря, а также токсического гепатита.

В основном корень Dangshen получают из трех видов Кодонопсиса: Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf., C. pilosula Nannf. var. modesta (Nannf.) L.T.Shen или C. tangshen Oliv. [12]. Однако другие пять видов C. tubulosa Kom., C. subglobosa W.W.Smith, C. clematidea (Shrenk) Clark, C. canescens Nannf. и C. lanceolata (Sieb. et Zucc.) Trautv. также могут являться заменителями лекарственного корня Кодо-нопсиса [9].

В Китае водный горячий экстракт из корней C. lanceolata стал применяться более тысячи лет на­зад при лечении мужской половой стерильности и импотенции, а также использовался как пищевая добавка в различные блюда. Недавно было показано, что биологически активные компоненты C.lanceolata обладают антиоксидантным [13] и цитотоксическим действием против раковых клеток [14]. Корнеплоды растений C. tangshen Oliv., или Chuan-Danshen, также хорошо известны в традици­онной китайской медицине тем, что иногда используются как заменители корня женьшеня и обладают тонизирующим действием [15]. C. pilosula (Franch.) Nannf. применяется в китайской народной медици­не при диспепсии, бронхитах, кашле, спазмах и воспалениях, а также используется в пищу [16].

Однако известны случаи отравления при применении недоброкачественных растительных пре­паратов и добавок, что, в свою очередь, привело к волне исследовательских работ с применением мо-лекулярно-генетических методов анализа с целью быстрой идентификации образцов растительного происхождения [17]. На сегодняшний день одним из популярных методов при идентификации, гено-типировании и изучении филогенетического родства между различными видами является метод сек-венирования ДНК.

Известно, что различные регионы генома эволюционируют с различной скоростью, что пригод­но при идентификации разных таксономических уровней. Регионы, не кодирующие белки, находятся под меньшим селективным давлением, хотя иногда могут иметь более вариабельные участки. По этим вариабельным участкам возможна дифференциация различных близкородственных организмов. Так, общеиспользуемыми при секвенировании локусами генома являются гены, кодирующие рибо-сомальную РНК (rDNA), и гены, находящиеся в митохондриальной и хлоропластной ДНК. Проведе­на расшифровка нуклеотидных последовательностей rDNA растений, используемых в китайской ме­дицине, таких как виды Panax species, Eucommia ulmoides (Duzhong), Cordyceps (Dongchongxiacao) species, Dendrobium (Shihu) species, Myospalax baileyi и Ligusticum chuanxiong (Chuanxiong). Кроме того, ряд авторов с целью молекулярно-филогенетического исследования всего семейства Campanu-laceae указывают на секвенирование внутреннего транскрибируемого участка (internal transcribed spacer (ITS)) рибосомальной ДНК (rDNA), интронной части генов matK/trnK [18], а также хлоропла-стной ДНК (cpDNA) [19]. Результаты секвенирования участков ITSI и ITSII rDNA четырех видов Co-donopsis Wall. показали высокую гомологию, но не идентичность [20].

Исходя из изложенного выше можно говорить о перспективности и актуальности изучения по­пуляции C. clematidea (Shrenk) Clark, произрастающей в юго-восточных регионах Казахстана, тем более, что работы по его генотипированию у нас не проводились. В связи с этим целью данной рабо­ты являлись генотипирование казахстанской популяции C. clematidea (Shrenk) Clark для создания и пополнения собственной базы данных о нуклеотидных последовательностях ДНК лекарственных растений Казахстана на основе секвенирования внутреннего транскрибируемого участка (internal transcribed spacer (ITS)) ITSI и ITSII рибосомальной ДНК (rDNA) и сравнительный анализ получен­ной нуклеотидной последовательности с референсными последовательностями через базу данных GenBank.

Материалы и методы

Образцы растений C. clematidea (Shrenk) Clark собраны в Аксайском ущелье Алма-Атинской об­ласти.

Выделение ДНК проводилось по СТАВ-методу [21] с некоторыми модификациями. Измерение концентрации выделенной ДНК было проведено на приборе NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США).

Амплификация проводилась с использованием специфичных к региону ITSI и ITSII праймеров: forward ITSI и reverse ITSIV (Синтол, Россия), любезно предоставленных лабораторией клеточной селекции и биотехнологии НЦБ КН МОН РК. Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) проведена на при­боре DNA Engine Tetrad 2 Cycler (Bio-Rad, США). Реакционная смесь состояла: 10 х раствор dNTPs (2 mmol/l каждого нуклеотида) 2,5pl, 10 х ПЦР буфер 2,5 pl, ДНК мишень (0,02 pg/pl) 5 pl, Taq ДНК полимераза 1U, 10 pmol/pl праймеры по 0,5 pl. Общий объем смеси доведен до 25 pl водой, свобод­ной от нуклеаз. Температурные условия амплификации следующие: преденатурация при 95°C в тече­ние 5 мин, денатурация при 95°C 30 сек, отжиг при 55°C 1 мин и элонгация при 72°C 1 мин. Всего режим амплификации состоял из 35 циклов. Последняя элонгация проводилась при 72°C в течение 7 мин. Для визуализации ПЦР-продуктов проведен электрофорез в 2 %-ном агарозном геле при 120 V.

Элюированные из геля и очищенные ПЦР-продукты были секвенированы с помощью набора BigDye terminator v3.1 sequencing kit (Applied Biosystems, США) на приборе 3730 DNA analyzer (Applied Biosystems, США) согласно протоколу фирмы-производителя. Анализ результатов секвени-рования осуществлен с использованием программы Vector NTI Advance 10 и базы данных GenBank NCBI. Построение дендрограммы проведено с помощью метода Neighbor Joining. Все эксперименты проведены в 2-3 повторностях.

Результаты

На электрофореграмме (рис.1) видно, что длина продукта амплификации составляет ~ 750 пар нуклеотидов (п.н.).

Рис. 1. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 2 %-ном агарозном геле: 1 — негативный контроль (Н₂О); 2 — ПЦР-продукт длиной ~ 750 п.н.; 3 — маркеры молекулярного веса, п. н.

Рисунок 2 демонстрирует часть нуклеотидной последовательности ITS региона rDNA, получен­ной при ПЦР с праймером forward ITSI.

Генотипирование лекарственного растения.

Сравнительный анализ, проведенный через базу данных GenBank (см. табл.), показал, что полу­ченная нуклеотидная последовательность ITSI и ITSII регионов rDNA растений C. clematidea идентична на 97 % секвенсам следующих видов: C. kawakamii, C. tangshen, C. pilosula и C. pilosula var. modesta, а также видам C. lanceolata и C. javanica subsp. japonica с идентичностью на 93 и 89 % соответственно.

Построение дендрограммы (рис. 3) по нуклеотидным последовательностям ITS регионов rDNA образцов, зарегистрированных в GenBank, позволяет видеть, что виды Кодонопсиса C. kawakamii, C. tangshen, C. pilosula и C. pilosula var. modesta имеют близкородственное положение и от вида C. kawakamii отходят отдельной и более отдаленной ветвью C. lanceolata и C. javanica subsp. japonica.

Делая выводы, отметим, что отсутствие данных о нуклеотидной последовательности C. cle-matidea (Shrenk) Clark, вероятно, обусловлено отсутствием соответствующих зарегистрированных последовательностей в использованной нуклеотидной базе GenBank NCBI. Кроме того, по некоторым данным установлено, что отдельные виды Codonopsis spp. невозможно дифференцировать по ITS ре­гиону рибосомальной ДНК, так как данная последовательность является высоко консервативной [22].

Нуклеотидная база данных GenBank NCBI (США) является свободно-доступной и одной из больших баз данных, наряду с такими, как EMBL (Европа) и DDBJ (Япония). Однако эти базы не включают информацию, хранящуюся и выдаваемую на платной основе в частных базах данных, ко­торые зачастую создаются при различных университетах. Известно, что результаты, полученные на большей базе данных, обладают большей биологической значимостью. Поэтому представляется не­обходимым создание и пополнение собственной базы данных о нуклеотидных последовательностях ДНК лекарственных растений Казахстана и их генотипирование по различным локусам генома в це­лях лучшего понимания сходства организмов и их взаимного расположения на эволюционном дереве. Перспектива видится в развитии молекулярно-генетических методов, основанных на сравнении их полных геномов, что на сегодня становится вполне возможным.

Список литературы

1. Lammers T.G. Circumscription and phylogeny of the Campanulales // Ann. Missouri Bot. Gard. — 1992. — 79. — P. 388­413.
2. Takhtajan A.L. Diversity and Classification of Flowering Plants. — New York: Columbia Univ. Press,
3. Aripova S.F. Alkaloid content of clematidea // Chemistry of natural compounds. — 1996. — Vol. 32. — № 4. — P. 564­566.
4. Perveen A., QaiserM. Pollen Flora of Pakistan —Campanulaceae // Tr. J. of Botany. — 1999. — Vol. 23. — P. 45-51.
5. Shulkina T.V., Gaskin J.F., and Eddie W. M.M. Morphological studies toward an improved classification of Campanulaceae s.str. // Ann. Missouri bot. Gard. — 2003. — 90. — P. 576-591.
6. Павлов Н.В. Растительное сырье Казахстана — М.-Л., 1947. — С. 459.
7. Флора СССР. Т. 24. - М.-Л.: Академия наук, 1957.
8. Иллюстрированный определитель растений Казахстана. — Алма-Ата: Наука КазССР, 1972. — С. 304.
9. Songlin Li, Quanbin Han, Chunfeng Qiao, Jingzheng Song, Chuen Lung Cheng and Hongxi Xu. Chemical markers for the quali­ty control of herbal medicines: an overview // Chinese Medicine. — 2008. — 3. — № 7. — P. 1-16. 
10. Li C., Xu H.X., Han Q.B., Wu T.S. Quality assessment of Radix Codonopsis by quantitative nuclear magnetic resonance // J.Chromatogr A. — 2009. — Vol. 1216. — № 11. — Р. 2124-2149.
11. Ishida S., Okasaka M., Ramos F., Kashiwada Y., Takaishi Y., Kodzhimatov O.K., Ashurmetov O. New alkaloids from the aerial parts of Codonopsis clematidea // J.Nat.Med. — 2008. — 62. — P. 236-238.
12. Chinese Pharmacopoeia Commission: Pharmacopoeia of the People's Republic of China Volume— Beijing: People's Medi­cal Publishing House, 2005. — Р. 197.
13. Soo-Hyun Kim, Hyun-Jin Choi, Hyun-Taek Oh, Mi-Ja Chungl, Cheng-Bi Cui2, and Seung-Shi Ham. Cytoprotective Effect by Antioxidant Activity of Codonopsis lanceolata and Platycodon grandiflorum Ethyl Acetate Fraction in Human HepG2 Cells // Korean J.Food Sci. Technol. — 2008. — 40. — № 6. — P. 696-701.
14. Lee K.-W., Jung H.-J., Park H.-J., Kim D.-G., Lee J.-Y., und Lee K.-T. b-D-Xylopyranosyl-(1^3)- b-D-glucuronopyranosyl Echinocystic Acid Isolated from the Roots of Codonopsis lanceolata Induces Caspase-Dependent Apoptosis in Human Acute Promyelocytic Leukemia HL-60 Cells // Biol. Pharm. Bull. — 2005. — 28. — № 5. — Р. 854-859.
15. Tsai T.-H. and Lin L.-Ch. Phenolic glycosides and pyrrolidine alkaloids from Codonopsis tangshen // Chem. Pharm. — 2008. — Vol. 56. — № 11. — P. 1546-1550.
16. , Zhao Y., Ruan Y., and Yang Y. Development and Application of a Capillary Electrophoretic Method for the Composi­tion Analysis of a Typical Heteropolysaccharide from Codonopsis pilosula Nannf. // Biol. Pharm. Bull. — 2008. — Vol. 31. — № 10. — Р. 1860-1865.
17. Pui Ying Yip, Chi Fai Chau, Chun Yin Mak and Hoi Shan Kwan. DNA methods for identification of Chinese medicinal mate­rials // Chinese Medicine. — 2007, 2:9. — Р. 234-253.
18. Eddie, W. M. M. A Global reassessment of the Generic Relationships in the Bellflower Family (Campanulaceae). D.Thesis, University of Edinburgh. — 1997), гена rbcL (Cosner, M. E., Jansen R. K. and Lammers T.G. Phylogenetic relationships in the Campanulales based on rbcL sequences // Pl. Syst. Evol. — 1994. — Vol. 190. — P. 79-95.
19. Eddie W. M.M., Shulkina T., Gaskin J., Haberle R.C., and Jansen R.K. Phylogeny of Campanulaceae s. str. inferred from its se­quences of nuclear ribosomal DNA // Ann. Missouri Bot. Gard. — 2003. — 90. — P. 554-575.
20. Fu R.Z., Wang J., Zhang Y.B., Wang Z.T., But P.H., Li N., Shaw P.C. Differentiation of medicinal Codonopsis species from adulterants by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism // Planta Medica. — 1999. — Vol. 65. —№ 7. — P. 648-650.
21. Doyle J.J. and Doyle J.L. A rapid isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. Bull. Bot. Soc. Amer. — 1987. — 19. — P. 11-15.
22. Zhang Y.-B., Shaw P.-C., Sze C.-W., Wang Z.-T. and Tong Molecular Authentication of Chinese Herbal Materials // Journal of Food and Drug Analysis. — Vol. 15. — № 1. — 2007. — P. 1-9.