Сравнительный анализ чувствительности тест-систем для определения Ureaplasma urealyticum методом ПЦР

Правильное и своевременное лечение заболеваний, вызываемых различными инфекционными агентами, требует установления точного диагноза. Для решения этой проблемы все чаще применяют­ся современные методы молекулярной биологии. Так, к настоящему времени метод амплификации нуклеиновых кислот полимеразной цепной реакцией (ПЦР) уже достаточно широко используется в практической медицине как эффективный инструмент лабораторной диагностики [1, 2].

Применение ПЦР в диагностике заболеваний, передаваемых половым путем (ЗППП), в настоя­щее время получило наиболее широкое распространение. Этому способствовал ряд причин, важней­шими из которых были недостаточная эффективность применяемых ранее методов лабораторной ди­агностики (микроскопия, бактериальный посев, иммуноферментный анализ), быстрота выполнения ПЦР (в среднем 1 сутки), а также, до некоторой степени, относительная простота манипуляций с клиническим материалом. Первая зачастую объясняется особенностями биологии патогенных микро­организмов, таких как мелкие размеры и невозможность (или затруднительность) культивирования вне организма человека [3].

Указанные особенности характерны для Ureaplasma urealyticum — возбудителя одного из наи­более распространенных ЗППП [4]. В настоящее время по распространенности уреаплазмоз «сопер­ничает» с хламидийной инфекцией. И хотя уреаплазмы высеваются бактериологически, это занимает от 3 до 5 суток [5, 6].

Диагностика уреаплазмозов методом ПЦР осуществляется благодаря налаженному производству сертифицированных тест-систем. Наибольшим спросом и, соответственно, распространенностью в лабораторной практике в станах СНГ пользуются тест-системы российского производства (НПФ «Литех», «Амплисенс^ТМ» ЦНИИЭ МЗ РФ, «Биоком», НПФ «ДНК-Технология» и др.). Не уступая по основным качественным характеристикам аналогам ведущих мировых производителей ПЦР тест-систем («Хоффман-Ла Рош», «Перкин-Элмер» и др.), продукция российских фирм выгодно отличает­ся в ценовом отношении, что, собственно, и является решающим фактором выбора.

Наиболее существенными характеристиками тест-систем для детекции ДНК патогенных микро­организмов являются чувствительность (способность обнаруживать наименьшие количества моле­кул-мишеней) и специфичность (способность реагировать только со специфическими последователь­ностями-мишенями) [7, 8]. К сожалению, рекламная информация фирм-изготовителей не всегда по­зволяет объективно оценить потребительские качества их продукции, тем более, что некоторые ха­рактеристики являются «know how» — а именно последовательности праймеров, а подчас и локали­зация последовательности-мишени.

Все сказанное обусловливает неизбежность и необходимость для практических лабораторий проводить систематическую исследовательскую работу по определению сравнительной эффективно­сти поступающих на рынок тест-систем.

Целью данного исследования была сравнительная характеристика эффективности тест-систем для амплификации ДНК патогенной бактерии Ureaplasma urealyticum производства «Амплисенс^ТМ» ЦНИИЭ МЗ РФ (в дальнейшем — «Амплисенс») и компании «Биоком» (далее — «Биоком»). 

Материалы и методы

Выделение ДНК из экспериментальных проб проводили с использованием наборов «ДНК-сорб А» и «ДНК-сорб B» («Амплисенс»), представляющих собой комплекты лизирующих и отмы-вочных растворов на основе детергентов и этилового спирта соответственно. Адсорбция ДНК осуще­ствляется на силикагелевом сорбенте.

Реакции амплификации ДНК осуществляли с использованием стандартных тест-систем фирмы «Амплисенс» и «Биоком» в режиме, рекомендованном фирмой-производителем.

Наборы для амплификации ДНК Ureaplasma urealyticum «Амплисенс» укомплектованы для применения технологии «горячего старта», который обеспечивается разделением праймеров, нуклео-тидов и Taq-полимеразы прослойкой воска. Расчетный объем реакционной смеси 25 мкл.

Наборы «Биоком» для амплификации ДНК Ureaplasma urealyticum представляют собой лиофи-лизированные концентрированные реакционные смеси (х2), расфасованные в 0,5 мл пробирки. Растворение лиофильного содержимого осуществляется добавлением специального раствора, постав­ляемого в комплекте (DNA-diluent). Расчетный объем реакционной смеси 20 мкл.

В качестве субстратов амплификации и, соответственно, молекул-мишеней использовали препа­рат ПКО (положительный контрольный образец) для U. urealyticum («Амплисенс»), содержавший 2,1 ГЭ/мл гена-мишени, а также образцы тотальной ДНК U. urealyticum из контрольной панели 7.

Электрофорез продуктов амплификации проводили с использованием наборов ЭФ-300 («Ампли-сенс»).

Результаты и обсуждение

В настоящей работе под специфичностью понимали узнавание идентичных молекулярных ми­шеней, что существенно отличается от понятия видовой специфичности тест-систем, позволяющей идентифицировать видовую принадлежность микроорганизма.

Исходной посылкой запланированных экспериментов являлось предположение о наличии по­следовательностей-мишеней для обеих изучаемых тест-систем в препарате «Положительный контрольный образец ДНК Ureaplasma urealyticum» (ПКО), представлявшем собой, согласно анали­тическому паспорту качества «Амплисенс», тотальную ДНК, выделенную из культуры уреаплазмы фенольным методом.

Целью экспериментов было выяснение степени идентичности используемых двумя фирмами-изготовителями последовательностей-мишеней.

Для этого был поставлен ряд реакций амплификации, в которых в качестве матрицы использова­ли препарат ПКО U. urealyticum в различных концентрациях (табл. 1).

Практически пробы были приготовлены последовательными разведениями с использованием буфера для разведения ДНК («Амплисенс»): 1: 95 мкл ТЕ + 5 мкл ПКО, 2: 50 мкл ТЕ + 50 мкл № 1, 3: 50 мкл ТЕ + 50 мкл № 2,

4: 50 мкл ТЕ + 50 мкл № 3.

Использование в качестве материала последовательных разведений имело целью определить одновременно степень чувствительности исследуемых тест-систем.

Было поставлено по 4 идентичных реакции каждой тест-системы. Условия проведения (поста­новка реакций, температурные режимы) соответствовали стандартам фирм-изготовителей.

Амплификацию проводили в аппарате с регулированием температур по матрице «Терцик-МС2», поэтому придерживались рекомендаций относительно температурного режима для аппаратов этого типа.

Последующий электрофорез продуктов амплификации обнаружил результаты, представленные на рисунке 1.

Анализ электрофореграммы показал отсутствие продуктов амплификации во всех пробирках с использованием тест-системы «Биоком». Неоднократное повторение эксперимента показало досто­верность полученных результатов и исключило возможность влияния производственного брака, кон­таминации или некорректной постановки реакций.

Отсутствие накопления продуктов амплификации ПКО в реакциях с использованием тест-системы производства «Биоком» означает явное отличие ее специфичности от таковой у «Ампли-сенс». То есть в реакциях используются разные праймеры для амплификации последовательностей одного и того же гена либо амплифицируются последовательности разных генов, избранных в каче­стве характерной мишени. Сказанное носит вполне ожидаемый характер, если принять во внимание различный предсказанный размер ампликонов (756 п.н. у «Биоком» и 450 п.н. у «Амплисенс»).

Полученные результаты также позволяют сделать вывод о неполном соответствии свойств пре­парата ПКО U. urealyticum («Амплисенс»), заявленных в аналитическом паспорте качества. Вероятно, препарат представляет собой генно-инженерную конструкцию, содержащую искусственную после­довательность-мишень, фланкированную соответствующими праймерами, как это имеет место в пре­парате ВКО.

Таким образом, поставленные эксперименты показали явное различие в специфичности тест-систем для детекции ДНК U. urealyticum производства «Амплисенс» и «Биоком».

Результаты, полученные в предыдущих экспериментах, не позволяли использовать для точного определения чувствительности тест-систем препараты ПКО или ВКО («Амплисенс»). Вместе с тем названные работы требуют использования растворов матриц с заранее известной концентрацией.

Оптимальным субстратом могла бы быть культура U. urealyticum с известным титром клеток. В качестве замены таковой использовали три пробы из контрольной панели для оценки качества рабо­ты лабораторий («Амплисенс») U. urealyticum. Концентрации ДНК в них были подобраны с расчетом получения определенного количества ДНК гена-мишени (табл. 2).

Представленные пробы содержали только ДНК U. urealyticum.

Однако процедура использования контрольной панели предусматривает предварительное выде­ление ДНК из проб по стандартной методике «Амплисенс», что подразумевает неизбежные потери.

С целью определения порядка потерь ДНК в ходе процесса выделения молекул нуклеиновых ки­слот были проведены контрольные эксперименты.

Предварительно приготовленные разведения препарата ПКО (концентрации — аналогично табл. 1.) использовали в качестве исходного материала для выделения ДНК с помощью набора «ДНК-сорб А» («Амплисенс»). Полученные в результате образцы использовали для постановки серии реакций ам­плификации с помощью тест-системы U. urealyticum «Амплисенс». Параллельно ставили серию ре­акций с исходными растворами ПКО, не подвергшимися процедуре выделения.

Сравнительный анализ последующего электрофореза реакционных смесей обнаружил явные различия в эффективности амплификации ДНК ПКО. Фотография электрофореграммы амплифицированных фрагментов исходных ДНК и молекул, подвергшихся обработке комплектом реагентов «ДНК-сорб А», представлена на рисунке 2.

Визуальный анализ данной электрофореграммы позволяет оценить степень потерь ДНК при обработке набором «ДНК-сорб А», по меньшей мере, как двукратную.

С учетом полученных данных концентрации ДНК U. urealyticum контрольной панели (табл. 2) следует рассматривать следующим образом (табл. 3).

Обнаруженную закономерность полезно учитывать при интерпретации результатов анализов клинических проб в повседневной практике клинико-диагностических лабораторий, осуществляю­щих ПЦР-анализ.

Собственно эксперимент по определению чувствительности тест-систем «Амплисенс» и «Био-ком» был осуществлен постановкой параллельных рядов реакций амплификации ДНК проб кон­трольной панели U. urealyticum. Результаты эксперимента представлены в таблице 4 и на рисунке 3. Картину электрофореза, представленную на рисунке, обрабатывали компьютерной системой Totallab.

Полученные данные свидетельствуют о том, что чувствительность тест-системы «Биоком», как минимум, в два раза ниже, чем таковая тест-системы «Амплисенс».

Данные денситометрического анализа фотоснимка коррелируют с визуальными, приведенными в таблице 4.

Таким образом, получены экспериментальные данные, доказывающие, как минимум, двукратное превышение порога чувствительности тест-системы «Амплисенс» по сравнению с тест-системой «Биоком».

Список литературы

1. Херрингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. — М.: Мир, 1999.
2. Colaizy T.T., Kuforiji T., Sklar R.S., Pillers D.A. PCR methods in clinical investigations of human ureaplasmas: a minireview. Mol. Genet. Metab. — 2003 Dec;80(4):389-97.
3. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — М.: Мир, 2002. — 589 с.
4. Агапов С.А. ПЦР в диагностике уреаплазм и микоплазм // Ureaplasma.info. — 2009. — 11 авг.
5. Rastawicki W., Kalota H., Jagielski M. et al. Comparison of polymerase chain reaction assay and Mycoplasma IST 2 test with culture for detection of infections caused by Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis // Med. Dosw. Mikrobiol. (Pol­and). — 2004. 56(1). — Р. 99-108.
6. Погосян Г.П., Ли К.Г., Жуманбаева Г.К., Подоляк С.С., Шалтаева Н.А. Применение ПЦР в диагностике инфекций, пе­редающихся половым путем, в Карагандинской области. Генодиагностика инфекционных заболеваний: Сб. тезисов 4-й Всерос. науч.-практ. конф. — М., 2002. — С. 62.
7. Pitcher D., Sillis M., Robertson J.A. Simple method for determining biovar and serovar types of Ureaplasma urealyticum clini­cal isolates using PCR-single-strand conformation polymorphism analysis // J.Clin. Microbiol (United States). — 2001. — — 39 (5). — Р. 1840-1844.
8. Kong F., Zhu X., Wang W et al. Comparative analysis and serovar-specific identification of multiple-banded genes of Ureaplas-ma urealyticum biovar 1 // J.Clin. Microbiol. — 1999. —; 37(3):538-543.