В статье представлены результаты изучения протективной активности моновалентной эмульгированной противоящурной вакцины на морских свинках. Установлены сроки формирования напряженного иммунитета после вакцинации против ящура на основе определения динамики образования комплемент связывающих, преципитирующих и вируснейтрализующих антители контрольного заражения вирулентным штаммом типа Азия-1.
Ключевые слова: ящур, антитела, перевиваемая культура клеток ВНК-21/13, серотип.
Введение Ящур –трансграничная, остропротекающая высококонтагиозная вирусная болезнь парнокопытных животных, характеризующаяся лихорадкой, везикулярным поражением слизистых оболочек ротовой полости, кожи венчика и вымени, обильным слюнотечением, у молодняка – поражением миокарда и скелетных мышц. Инфекция может очень быстро распространяться на большие территории, поражая различных животных и нанося ощутимый экономический ущерб животноводческой отрасли [1, 2, 3, 4].
В настоящее время ящур продолжает оставаться самым распространенным заболеванием парнокопытных животных, способным протекать в виде эпизоотий и вызывать чрезвычайные ситуации в животноводстве с тяжелыми социально- экономическими последствиями. Анализ официальных данных МЭБ свидетельствует о довольно напряженной ситуации в мире по данной инфекции. Так, в 2004 -2005гг. неблагополучными по ящуру были 59 стран, в том числе 27 азиатских, 26 африканских и 5 южноамериканских [3, 4, 7]. В последние годы в мире отмечается тенденция к возрастанию числа вспышек ящура типа Азия-1. В сентябре 1999 года, впервые после 1991 года, ящур этого типа был зарегистрирован в Иране. В октябре 1999 года его установили в Турции, затем в 2000-2001 гг. он был занесен в Армению и Грузию, Грецию и Азербайджан, а в 2003 году – ив Таджикистан. В 2001-2005гг. вспышки ящура типа Азия-1 отмечены также в Афганистане, Индии, Китае, Монголии, Пакистане, Таиланде. В первом полугодии 2006 года о неблагополучии по ящуру официально в МЭБ сообщили 10 государств [5]. Первые случаи ящура данного типа в Китае были отмечены среди КРС в зоне предубойного содержания животных на бойне в Гонконге 9 марта 2005 года. В последующее время с апреля по декабрь 2005 года вспышки ящура типа Азия1 были зарегистрированы и на территории континентального Китая в 7 из 30, имеющихся провинций на юго-востоке, востоке, северо-западе и в центре страны. Особое внимание было обращено на две вспышки, зарегистрированные в мае и июне 2005 года в Синьцзян-Уйгурском автономном районе, который располагается на северо-западе КНР и граничит с Казахстаном, Киргизией, Таджикистаном, Монголией и Россией[6,8,9].
Во второй половине 2003 и в начале 2004 годов в южном регионе нашей страны были (Алматинской и Южно-Казахстанской областях) зарегистрированы случаи заболевания парнокопытных животных ящуром. В процессе проведения комплексных лабораторных исследований патологических материалов, поступивших из различных районов Южного региона были выделены полевые штаммы вируса ящура, которые при серологических исследованиях были идентифицированы как серотип Азия-1 возбудителя ящура. В предыдущие годы в результате проведенных научно-исследовательских работ нами получен производственный штамм для изготовления диагностических и профилактических препаратов.
Целью проведенных нами исследований являлось изучение иммунобиологических свойств экспериментальной серии культуральной инактивированной вакцины против ящура, изготовленной с использованием полевого штамма типа Азия-1.
Материалы и методы исследований В научно-исследовательских работах использован выделенный на территории Казахстана и адаптированный к перевиваемой линии культур клеток ВНК-21/13 штамм «№13/КазНИВИ» типа Азия-1.
Для получения биологической массы полевого штамма использовалась перевиваемая культура клеток ВНК-21/13. Штамм репродуцировали в 3-х литровых роллерных стеклянных сосудах. Культивирование вируса проводили следующим образом: на питательной среде Игла-МЕМ на растворе Хенкса,в роллерные сосуды со сформировавшимся монослоем вносили свежую порцию поддерживающей среды без сыворотки и вирусный материал в дозе 0,01 ТЦДкл. Инфицированные культуры выращивали на роллерном аппарате при 12 об/ч в термальной комнате при температуре 37° С до проявления признаков цитопатогенного действия на 80-90% площади монослоя клеток (ЦПД). Пораженные сосуды замораживали при температуре минус 20 ºС и размораживали при комнатной температуре, затем вирусную суспензию объединяли в один емкость и брали пробы для определения биологической активности и стерильности. Титр вируса выражали в Ig ТЦД50/мл и рассчитывали по Риду и Менча.
Очистку биологической массы полевого штамма проводили 2% хлороформом с последующей центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин.
Инактивацию вирусной суспензии серотипа Азия-1 проводили при температуре 25º С димеромэтиленимина в течении 30 часов.
Авирулентность вируссодержащей суспензии проверяли методом инфицирования перевиваемой линии клеток ВНК-21суточного возраста в течение трех последовательных пассажей.
После получения отрицательных результатов на контаминацию посторонней микрофлорой и результатов авирулентности вируссодержащую суспензию делили на две части: первую часть суспензии сорбировали гелью гидрата окиси алюминия, а другую смешивали с масляным адъювантом ISA-206 согласно протоколу по применению. После отстаивания в течение 24 часов вакцину считали готовой к применению.
В эксперименте по изучению иммуногенеза индуцируемой адсорбат вакциной и эмульгированной вакцинами использовали интактных взрослых морских свинок массой не менее 600-700 г. Животных иммунизировали внутримышечно в дозе 2 см3 по 1 мл в задние ноги. Через определенный промежуток времени у вакцинированных животных брали пробы крови для определения динамики образования специфических антител против возбудителя ящура в серологических реакциях связывания комплемента (РСК), преципитации (РДП) и нейтрализации (РН).
Постановка и учет результатов серологических реакций проводили согласно методическим указаниям.
Результаты исследований и их обсуждение При изучении иммунобиологических свойств инактивированной эмульгированной культуральной вакцины против ящура типа Азия-1 основными критериями показателя эффективности разработанной вакцины служили сроки индуцирования иммунитета, его напряженность и продолжительность. Иммунобиологические свойства эмульгированной вакцины изучали в сравнении с таковыми классической гидроокись алюминиевой вакцины (ГОА-вакцина) против ящура серотипа Азия-1.
Морских свинок делили на группы по три в каждой, для проверки сроков наступления и напряженности иммунитета, одну группу животных оставляли контрольной. Через 5, 10, 14 и 21 сутки после иммунизации, у животных брали пробы крови для определения уровня комплементсвязывающих, преципитирующих и вируснейтрализующих антител против полевого штамма серотипа Азия-1 вируса ящура. Для определения напряженности иммунитета на 14 и 21 сутки после введения препарата проводили контрольное заражение вирулентным вирусом данного типа. Результаты проведенных исследований представлены на таблице 1.
Таблица 1 – Титры комплементсвязывающих антител у морских свинок, привитых инактивированной культуральной ГОА- и эмульгированной вакцинами против ящура типАзия-1
Данные представленные в таблице1свидетельствует о том, что использованные противоящурные вакцины у морских свинок индуцировали образование специфических антител против возбудителя ящура к типу Азия-1на 5 сутки после иммунизации. В вышеуказанные сроки установлены комплементсвязывающие антитела в пробах цельной сыворотки. На 10 и 14 сутки после вакцинации в сыворотках крови лабораторных животных титр специфических антител повысился на один порядок и составил от 1:2 до 1:8постепенно повышался. Через 21 сутки после иммунизации в группе животных, привитых эмульгированной вакциной титры типоспецифических антител равнялась1:32, тогда как у животных вакцинированный сорбированным препаратом уровень антител не превысил 1:16.
У вакцинированных животных в течение наблюдаемого срока каких-либо патологических изменений в общем состоянии не отмечено, но в точках инъекций вакцины установлены плотные инфильтраты, которые в начале давали местную температурную реакцию, а затем рассасывались. Общее состояние животных были удовлетворительным, и температура тела оставалась на уровне физиологической нормы.
При оценке иммуногенной активности противоящурных вакцин и поствакцинального иммунитета определение уровня преципитирующих антител имеет одно из ключевых значений. При проведении массовых исследований животных определение содержания специфических антител в их сыворотки крови является одним из простых и достоверных способов методов диагностики ящура. В этой связи в процессе проведения экспериментов, нами изучена иммуностимулирующие активности сорбированной и эмульгированной вакцин и их влияние на динамику образования преципитирующих антител. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Таблица 2 – Титры преципитирующих антител у морских свинок, привитых инактивированными культуральными вакцинами против ящура типа Азия-1
Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что у морских свинок, иммунизированных противоящурными препаратами, на 5 сутки линии взаимодействия преципитирующих антител и специфического антигена установлены только в цельных пробах. В пробах сывороток, полученных на 10 и 14 сутки, титр антител повысилась до 1:8, а на 21 сутки до 1:16.
На следующем этапе исследований изучено влияние сорбированной и эмульгированной вакцин на процесс образования вируснейтрализующих антител против возбудителя ящура типу Азия-1. Данные антитела активно участвуют при нейтрализации возбудителя инфекции и являются важными показателями иммуногенной активности инактивированной вакцины против ящура. Результаты исследований представлены в таблице 3.
Таблица 3 – Титры вируснейтрализующих антител у морских свинок, привитых культуральными вакцинами против ящура типа Азия-1
В таблице 3 продемонстрированы результаты оценки иммуногенной активности моновалентных сорбированной и эмульгированной вакцин изготовленных из гомологичного штамма Азия-1 на лабораторных животных. Препараты активно индуцировали образование вируснейтрализующих антител против типоспецифического антигена вируса. В реакции нейтрализации специфические антитела были обнаружены на 5 день после прививки в разведении 1:2, далее титры антител повышались и на 21 сутки после иммунизации их уровень находился в пределах от 1:16 до 1:32.
Результаты изучения динамики накопления специфических антител в серологических тестах показали, что после введения животным инактивированных вакцин в их организме активно происходит интенсивная коррекция иммунной системы - антитела накапливаются в достаточно высоком уровне. Для оценки напряженности иммунитета привитых животных подвергали контрольному инфицированию вирулентным штаммом серотипа 3 Азия-1, гомологичной вакцинному, на 14 и 21 сутки в дозе 104 ИД50/01см вакцинации. Результаты исследовании представлены в таблице 4 .
Таблица 4 – Результаты контрольного заражения морских свинок, привитых опытными вакцинами.
Данные, приведенные в таблице 4, показывают, что различные типы инактивированных вакцин против ящура активно стимулируют образование противовирусного иммунитета и обеспечивают невосприимчивость привитых животных к заболеванию. При контрольном заражении иммунных животных через 14 суток после иммунизации, ГОА-вакцина предохраняет от вирулентного вируса 88,8% иммунизированных животных. Животные, привитые масляной вакциной были невосприимчивыми эпизоотическому штамму серотипа Азия-1в 100% случаях. Результаты эксперимента инфицирования вакцинированных и контрольной групп морских свинок (на
21 сутки) показали, что обе вакцины активно индуцировали достаточный уровень вируснейтрализующих антител против серотипа Азия-1, что обеспечивало напряженный иммунитет против вируса ящура серотипа Азия-1. У морских свинок контрольной группы на 4-5 сутки после инъекции вирулентного вируса отмечено развитие характерных клинических симптомов ящура и генерализованной формы болезни.
Выводы Проведенные исследования показали, что культуральные инактивированные вакцины, изготовленные с использованием эпизоотического изолята вируса ящура типа Азия-1, выделенного во время вспышек ящура в 2004 г. в южных регионах страны обладают высокой проективной активностью и создают невосприимчивость у 88,8% животных на 14 сутки после иммунизации. Адъюванты ГОА и ISA-206 усиливают и активно пролонгируют иммуногенез против вирусных белков.
Литература
- Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и др. Вирусные болезни животных.- М.: ВНИТИБП, 1998. С. 532–548.
- Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур.-М.: Агропромиздат, 320 с.
- Муминов Д.М., Фомина Т.А., Егорова А.И. и др. Характеристика изолята вируса ящура типа Азия-1, выявленного в Таджикистане в 2004 году Пробл. мониторинга и генодиагн. инфекц. болезней ж-ных // Матер.междунар. науч. конф. молодых ученых.-г. Владимир, 24–26 марта 2004.- С. 8–12.
- Valarcher F., Ferris N., Knowles N.J. eta. l. Annual OIE/FAO FMD reference laboratory network report // January-November, 2005. 32 p.
- Control of Infectious Animal Disease by Vaccination: Proc. Conf. Buenos Aires, 13–16 April 2004 /е A. Schudel, M. Lombard. Basel etc.: Karger, 2004. 515 p.
- Фомина Т.А., Спирин В.К., Щербаков А.В. и др. Результаты изучения иммунобиологических свойств эпизоотических штаммов вируса ящура типа Азия-1, выделенных в Закавказье Актуал. пробл. инфекц. патологии ж-ных// Матер. междунар. науч. конф., посвящен. 45-летию ФГУ ВНИИЗЖ.-г. Владимир, 2003. С. 32–34.
- Жильцова М.В., Изучение репродуктивных свойств изолятов вируса ящура типа Азия-1, выделенных в России во время вспышек в 2005-2006 гг., // Ветеринарная Патология. - №4.-С. 31-34.
- Фомина C.Н., Комплексное изучение антигенного родства штаммов вируса ящура типа Азия-1// Ветеринарная Патология. №4.С. 34-37.
- http://www.oie.int.