Сравнительное изучение жизнеспособности овариальных фолликулов овец после витрификации с диметилсульфоксидом и пропандиолом

Криоконсервация овариальной ткани является альтернативным методом сохранения  генетического  материала  животных.  В  данном  исследовании  мы  сравнили жизнеспособность  овариальных  фолликулов  витрифицированной  ткани  яичника  овец  c 4,5М     диметильсулфоксидом     (DMSO)     и     5М     пропандиолом         (PROH).     После гистологического      анализа      процент      морфологически      нормальных      фолликулов криосохраненной ткани составил: с 1,5 М DMSO  ̶  примордиальных - 39,8%; первичных - 30,4 % и вторичных -  19,6 %; 1,5М  PROH - 48,8%; 37,1% и 24,9%, а в контрольной группе - 95,8%; 92,9 % и 89,6%, соответственно. Таким образом, установлено, что использование 5М PROH оказывает более эффективное действие на жизнеспособность овариальных фолликулов при витрификации, чем использование 4,5М DMSO.

Введение Генетические ресурсы животных представляют ценный и стратегически важный капитал любой страны, так как они связаны с решением проблемы обеспечения населения страны продовольствием, промышленности – сырьем. Для решения данной проблемы в развитых странах мира проводятся интенсивные научные исследования по сохранению и рациональному использованию как культурных, созданных на основе искусственного отбора и подбора пород домашних животных, так и аборигенных пород и популяций животных, сформировавшихся в течение многих столетий на базе естественного отбора и народной селекции.

Сохранить генетический материал и репродуктивный потенциал можно не только за счет выделения и сохранения отдельных яйцеклеток и получаемых из них эмбрионов, но и путем криоконсервации самой функциональной (кортикальной) ткани яичника, технология которой так же включает методы медленного замораживания [1,2,3] и витрификации [4,5,6,7]. Медленное замораживание остается наиболее широко используемым методом в клинике. Более низкие концентрации криопротектантов используются в составе крипротекторов для медленного замораживания, что снижает риск токсического и осмотического повреждения клеток, но следует учитывать, что это не предотвращает образование кристаллов льда, которое приводит к уменьшению выживаемости клеток во время замораживания [8]. Витрификация считается относительно новым методом замораживания, о нем были опубликованы статьи как об эффективном альтернативном методе для криосохранения тканей яичников различных видов, в том числе мыши [9,10], крысы [11], свиньи [12], козы [13], овец [14, 15], обезьяны [16] и человека [17, 18]. Данный метод сочетает в себе быструю скорость замораживания и большую концентрацию криопротектантов в составе витрификационных растворов, которые быстро обезвоживают клетки при этом, предотвращая образование кристаллов льда [8].

С точки зрения криобиологии задача ученых состоит в повышении выживаемости овариальной ткани после криоконсервации. В связи с этим, целью нашего исследования является изучение влияния различных криопротекторов: 4,5М диметильсулфоксида (ДМСО) и 5 М пропандиола (PROH) на выживаемость тканей яичников при витрификации.

Материалы и методы Реагенты. Все реагенты, использованные в данном исследовании были куплены от Sigma-Aldrich (Германия).

 

Коллекция кортикальной ткани 30 яичников 2,5 годовалых овец аборигенной Чуйской популяции были взяты путем забоя животных, транспортировались в лабораторию при 37оС в фосфатно-солевом буфере Дюльбекко (DPBS).  Яичники освободили от связок и промыли несколько раз в PBS с антибиотиками (пенициллина, стрептомицин). После снятия макроскопических данных удаляли мозговую часть яичника, а кортикальную часть разделили на мелкие кусочки c размером 0,5х0,5х1 см.

Экспериментальный план Полученные кусочки овариальной ткани поделили на три главные экспериментальные группы: группа I, криопротектор 4,5М диметилсульфоксид (ДМСО) и группа II, криопротектор 5М пропандиол (PROH); группа III, контрольная, не подвергалась воздействию криопротекторов и не витрифицировалась;

Витрификация и нагревание овариальной ткани

Яичники были витрифицированы по методу Lane et al. (1999). Образцы эквилибрировали в  следующих  витрификационных растворах:

Группа I - 1,125 М и 2,25 М DMSO на фосфатно-солевом буфере Дюльбекко образцы эквилибрировали по 10 минут, затем в витрификационном растворе (VS) – 4,5 М DMSO на фосфатно-солевом буфере Дюльбекко в течение 5 мин;

Группа II - 1,25 М и 2,5 М PROH на фосфатно-солевом буфере Дюльбекко по 10 минут; затем в витрификационном растворе (VS) – 5,0 М PROH на фосфатно-солевом буфере Дюльбекко в течение 5 мин. После этого образцы из криозащитной среды переносили в соломинку (straws, IMV technologies емкостью 0,5 см3). Соломинки заполняли в соответствии с требованиями IETS. Свободный конец соломинки запаивали и затем погружали в жидкий азот и хранили в сосудах Дьюара в течение одной недели. Для размораживания, витрифицированные образцы в соломинках 5 сек. держали в атмосферном воздухе при комнатной температуре, затем помещали на 25оC водяную баню. Для удаления криопротекторов проводили обратную эквилибрацию в растворах с понижающейся концентрацией криопротектора с добавлением сахарозы (Sigma, USA).

Гистологическая обработка Свежие и витрифицированные образцы овариальной ткани фиксировали в 10% формалине в течение 24 часов, дегидратировали и заключали в парафиновые блоки. С каждого образца делали серийные срезы толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван Гизону по стандартной методике. Исследование полутонких и гистологических препаратов осуществляли с помощью светового микроскопа при увеличениях объектива х20 их40. Микрофотосъемку осуществляли с помощью микроскопа Zeiss Axiostar plus, «Видеотест морфология». Осуществляли анализ гистологических срезов, изучая только фолликулы с видимым ядром для исключения повторного счета одного и того же фолликула в анализируемом срезе. Количество нормальных и дегенеративных фолликулов выражали в процентах по отношению к общему числу фолликулов в образцах.

Результаты исследований В ходе морфологического исследования изучалась морфология примордиальных, первичных и вторичных фолликулов в овариальной ткани и была проведена морфологическая оценка их качества. Микроскопический анализ окрашенных гематоксилин эозином и Ван Гизоном препаратов свежей ткани показали неповрежденную морфологию примордиальных и первичных фолликулов с плотным контактом между ооцитом и окружающими гранулезными клетками, а также между соседними гранулезными клетками (Рис. 1a и b). Большинство вторичных фолликулов свежей ткани показали ооциты с агранулярной цитоплазмой и центрально расположенным ядром окруженной несколькими слоями гранулезных клеток и хорошо организованный текальный слой. В ооцитах фолликулов наблюдалось однородное распределение цитоплазмы (Рис. 1c).

Представленные микрофотографии фиксированной овариальной ткани: свежие (a, b,c) и витрифицированные ткани (d,e,f).

Рис 1. Представленные микрофотографии фиксированной овариальной ткани: свежие (a, b,c) и витрифицированные ткани (d,e,f). Свежая овариальная ткань показала примордиальные (а), первичные (b), вторичные (c), фолликулы со здоровым ооцитом и плотным компактным слоем гранулезных клеток. После витрификации морфология гранулезных клеток различного класса фолликулов главным образом были сохранены (d-f); однако, нечасто, повреждение включало сморщенных (d, стрелка) или вакуолизированных ооцитов (e, стрелка), а также наблюдалось неправильное пространство между фолликулами и стромой (f, стрелка). Увелечение х20, х40. 

Морфологический анализ сохранности примордиальных и первичных фолликулов во фрагментах овариальной ткани витрифицированных двух групп показали некоторые повреждения. Были обнаружены сморщенные (Рис. 1. d,e,g,h) и вакуолизированные ооциты, а также неправильное пространство между фолликулами и стромой (Рис. 1f, стрелка). Во всех группах свежей и витрифицированной ткани с использованием различных криопротекторов белочная оболочка ткани была плотной и компактной стромой.

Таблица 1 - Относительное количество (%) морфологически нормальных фолликулов в овариальной ткани яичников овец после замораживания и оттаивания при использовании различных криопротекторов. 

Относительное количество (%) морфологически нормальных фолликулов в овариальной ткани яичников овец после замораживания и оттаивания при использовании различных криопротекторов.

Сопоставляя данные, представленные в таблице 1, следует отметить, что количество морфологически нормальных примордиальных фолликулов в двух группах 4,5М DMSO 41,3 ± 3,9a и 5М PROH 49,4 ± 2,3a витрифицированной овариальной ткани выше по сравнению первичными 32,9 ± 2,5a , 36,7 ± 3,3a и вторичными 20,7 ± 3,9, 25,3 ± 4,1 фолликулами. Данный факт, по всей видимости, можно объяснить тем, что примордиальные фолликулы имеют небольшие размеры, клеточную стадию деления (профаза 1-го мейотического деления), низкую метоболическую активность, отсутствие zona pellucida, монослой клеток гранулезы. Это, очевидно и определяет устойчивость популяции данных клеток к действию криоповреждения.

Заключение Проведенные исследования показали, что процентное соотношение морфологически нормальных фолликулов в витрифицированной группе с использованием 5М PROH было выше, чем 4,5 DMSO. Криоконсервация овариальной ткани позволяет сохранить примордиальные и первичные фолликулы содержащимися в них незрелых ооцитов (примордиальные и первичные фолликулы). Для оплодотворения такие фолликулы должны пройти стадию созревания in vivo или in vitro. Поэтому в будущем не исключается возможность использования метода in vitro культивирования овариальных фолликулов из криоконсервированных фрагментов ткани яичника для всестороннего исследования размороженных образцов.

 

Литература

  1. Hovatta O. Methods for cryopreservation of human ovarian tissue//Reproductive 2005. - Online Vol.10.-P. 729–734.
  2. Isachenko V, Isachenko E, Reinsberg J, Montag M, van der Ven K, Dorn C,Roesing B &  van  der  Ven  H.     Cryopreservation  of  human  ovarian  tissue:  comparison  of  rapid   and conventional freezing// Cryobiology. – 2007. – Vol. 55.-  Р. 261–268.
  3. Jin S, Lei L, Shea LD, Zelinski MB, Stouffer RL & Woodruff Markers of growth and development in primate primordial follicles are preserved after slow cryopreservation // Fertility and Sterility. - 2010. – Vol. 93.- Р. 2627–2632.
  4. Li YB, Zhou CQ, Yang GF, Wang Q & Dong Y. Modified vitrification method for cryopreservation of human ovarian tissues//Chinese Medical Journal. –2007.- Vol.120.–Р. 110– 114.
  5. Huang , Mo Y., Wang W., Li Y., Zhang Q. & Yang D. Cryopreservation of human ovarian tissue by solid-surface vitrification// European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. – 2008. – Vol.139. – Р.193–198.
  6. Быстрова О.В., Калугина Ф.С., Цыбатова Е.В. Способы восстановления фертильности у онкобольных // Практическая онкология. Т.10. № 4. С. 245–253.
  7. Huang , Mo Y., Wang W. et al.Criopreservation of human ovarian tissue by solid- surface vitrification //Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2008. V. 139. № 2. Pp. 193–198.
  8. Vajta G. Are programmable freezers still needed in the embryo laboratory? Review on vitrification Reproductive Biomedicine. -2006. -Online Vol.12. –Р.779–796.
  9. Wang X, Catt S, Pangestu M & Temple-Smith P. Live offspring from vitrified blastocysts derived from fresh and cryopreserved ovarian tissue grafts of adult mice//Reproduction.- 2009.- Vol.138.- Р.527–535.
  10. Fatehi R., Ebrahimi B., Shahhosseini M., Farrokhi A., Fathi R. Effect ovarian tissue vitrification method on mice preantral follicular development and gene expression//Theriogenology 81. –2014.- Р.302–308.
  11. Deng X., Zheng H., Yu X., Yu H., Zhang C., Chao L., Li R. & Liu W. Cryopreserved ovarian tissues can maintain a long-term function after heterotopic autotransplantation in rat// - 2009.- Vol.138.- Р.519–525.
  12. Gandolfi , Paffoni A., Papasso Brambilla E., Bonetti S., Brevini TAL & Ragni G. Efficiency of equilibrium cooling and vitrification procedures for the cryopreservation of ovariantissue: comparative analysis between human and animal models// Fertility and Sterility. – 2006. – Vol.85.- Р.1150–1156.
  13. Santos R.R., Tharasanit T., Van Haeften T., Figueiredo J.R., Silva J.R. & Van den Hurk R. Vitrification of goat preantral follicles enclosed in ovarian tissue by using conventional and solid-surface vitrification methods//Cell and Tissue – 2007. - Vol.327. – Р.167–176.
  14. Al-aghbari A.M. & Menino A.R. Survival of oocytes recovered from vitrified sheep ovarian tissues//Animal Reproduction Science. – 2002. – Vol. 71.- Р.101–110.
  15. Courbiere , Odagescu V., Baudot A., Massardier J., Mazoyer C., Salle B. & Lornage
  16. Cryopreservation of the ovary by vitrification as an alternative to slow-cooling protocols// Fertility and Sterility. – 2006. - Vol.86.- Р.1243–1251.
  17. Ting A.Y., Yeoman R.R., Campos J.R. & Zelinski M.B. Morphological and functional preservation of pre-antral follicles after vitrification of macaque ovarian tissue in a closed system//Hum.reprod. – 2013.- Vol.0.- Р.1–13.
  18. Keros V., Xella S., Hultenby K., Pettersson K., Sheikhi M., Volpe A., Hreinsson J. & Hovatta Vitrification versus controlled-rate freezing in cryopreservation of human ovarian tissue// Human Reproduction. – 2009.- Vol.24.- Р. 1670–1683.
  19. Zhou XH., Wu YJ., Shi J., Xia Y.X. & Zheng S.S. Cryopreservation of human ovarian tissue: comparison of novel direct cover vitrification and conventional vitrification//Cryobiology.– 2010. – Vol.60. – Р.101–105.
Фамилия автора: Сейсенбаева А.С., Тойшибеков Е.М.
Год: 2015
Город: Алматы
Яндекс.Метрика