Перспективы получения и использования межвидовых гибридов рапса

В предлагаемой статье обсуждаются перспективы использования отдаленной гибридизации в  селекционной практике рапса.

Наилучшими родственными видами для создания отдаленных гибридов являются горчица сарептская (Brassica juncea) и сурепица (Brassica campestris). При этом для повышения эффективности исследований необходимо использование современных методов цитогенетики (FISH, GISH), эмбриокультуры и культуры изолированных микроспор.

Введение По данным Статистического агентства Казахстан в среднем за год за период 2007–2011 годов экспортировал рапса на сумму 17642000 долларов США, в тоже время импортировал рапс на сумму 1415000 долларов США, в основном за счет закупки семян сортов иннорайонной селекции.

В селекционной работе по выведению новых казахстанских сортов рапса преобладают традиционные методы. Сроки создания отечественных сортов затянуты и не отвечают современным требованиям. Поэтому среди возделываемых в Казахстане сортов рапса преобладают сорта инорайонной селекции. При этом, селекционная работа над созданием новых сортов затруднена низким уровнем вариабельности среди исходного материала. Одним из выходов из этой ситуации является привлечение в скрещивание близкородственных видов, имеющих ряд положительных признаков, которые могут быть привнесены в рапс. Более того, в перспективе возможно  создание высокопродуктивных  и с надлежащим качеством масла константных гибридных линий, которые будет возможно выращивать непосредственно в производстве.

Основным лимитирующим фактором для рапса является его низкая засухоустойчивость. Кроме того, для улучшения технологических качеств получения масла, желательно иметь желтые семена. Поскольку в Северном Казахстане, основном регионе выращивания рапса, основным источником воды для растений является весенняя влага, необходимы сорта с укороченным вегетационным периодом, для более эффективного его использования.

Одним из перспективных направлений селекционных работ является скрещивание рапса (Brassica napus) с горчицей сарептской (Brassica juncea) и сурепицей (Brassica campestris) для получения гибридных линий устойчивых к засушливым условиям Северного Казахстана. В дальнейшем отбор гибридных линий с хорошими количественными признаками урожайности, с признаками желтосемянности и качеством семян соответствующим технологическим требованиям, предъявляемым к каноле (низкое содержание эруковой кислоты и глюкозинолатов).

Горчица сарептская (Brassica juncea), имея геномный состав ААBB, (n = 18) отличается от рапса (Brassica napus), у которого геномный состав AACC (n = 19). Центром происхождения горчицы считается Центральная Азия. Культура неприхотлива, устойчива к абиотическим и биотическим стрессовым факторам. В природе рапс и горчица сарептская могут свободно скрещиваться [1]. При проведении принудительного скрещивания этих двух видов отмечено, что наилучшая завязываемость происходит, когда рапс является материнским родителем, при этом с помощью молекулярных маркеров и FISH метода показано, что фрагмент хромосомы B генома горчицы присутствует в межвидовом гибриде [2]. Интересно, что при скрещивании рапса и горчицы можно ресинтезировать другой вид, именно, засухоустойчивую эфиопскую горчицу Brassica carinata с геномным набором BBCC. В результате чего получена линия эфиопской горчицы с улучшенными качественными показателями масла [3]. В другом случае, при скрещивании желтосемянной горчицы сарептской (AABB), желтосемянной капусты (CC), и черносемянного рапса (AACC) получены линии желтосемянного гибрида с различным набором хромосом разных геномов [4]. Более того, проводятся попытки создания гексаплоидного полиплоида с геномным набором ААВВСС [5]. Показано, что горчица сарептская в засушливых условиях более урожайна, чем рапс, она имеет более укороченный вегетационный период, чем у рапса [6], а также устойчива к осыпанию [7].

Исследования проведенные с гибридами рапса и горчицы показали перспективность селекционной работы по устойчивости к выращиванию в засушливых условиях [8].

Cурепица (Brassica campestris) в отличие от рапса имеет геном АА, количество хромосом в гаплоидном состоянии n=10. В современных мировых статистических данных не  всегда  разделяют  посевы  рапса  и  сурепицы.  Часто  именуя  эти  культуры термином «канола», подразумевая пищевое использование масла семян, с низким содержанием эруковой кислоты и глюкозинолатов. В то же время, сурепица имеет более короткий вегетационный период, более продуктивна в местностях с суровым климатом и на бедных почвах.

Уникальность семейства Brassica состоит в том, что в настоящее время найдены способы принудительного скрещивания его видов между собой, в результате чего могут быть получены синтетические комплексы из различных видов и соответствующих им полиплоидов. Таким образом, могут быть получены одни из самых уникальных модельных систем для исследований влияния полиплоидии на урожай растения [9]. Появляется возможность наблюдать за тем, как те, или участки геномов могут повлиять на проявление тех, или иных признаков в гибридном материале [10]. Гибриды между Brassica napus и родственных видов могут относительно легко создаваться, что является идеальным способом получения новых форм растений с признаками устойчивости, примером служит B геном - Brassica niger [11,12]. Более того, используя современные биотехнологические методы, такие как выращивание межвидовых эмбрионов in vitro для преодоления барьера несовместимости, появилась еще большая возможность создавать межвидовые и межродовые гибриды между B. napus и широким спектром соответствующих сельскохозяйственных культур и диких видов [13,14]. Стратегию получения гибридов можно значительно упростить путем определения потомства цитологическими методами, что позволяет отбирать растения, содержащие желаемый признак с минимальным фоном генома донора.

В 1993 году Maluszynska и Heslop-Harrison [15] были первыми, кто описали ряд 18S - 5.8S - 25Sр ДНК локусов в диплоидах Brassica (Brassica nigra, Brassica oleracea и Brassica napus) и аллотетраплоидах (Brassica carinata, Brassica juncea и Brassica napus). Локализация 25Sр ДНК зондов FISH у видов Brassica [15,16] позволили провести геномные сравнения рДНК-несущих хромосом в амфидиплоидных видах с их диплоидным предшественником. Комбинируя эту технику с методом компьютерной визуализации, выявлены «количественные кариотипы» для диплоидных видов Brassica на основе измерений компьютерной-денситометрии длин хромосом и центромерных позиций [17]. В гибридизации с 45S и 5Sр ДНК получены маркеры для 20 из 36 хромосом B. juncea [18]. В хромосомах высших растений 45S и 5Sр ДНК физически разделены и картируются независимо друг от друга.

Более точное определение хромосомных перестроек может быть получено с использованием комбинированного FISH/GISH метода [19,20], который используется в гибридизации с общей геномной ДНК в качестве зонда, чтобы отличить геномы и с хромосом специфическими ДНК-зондами для идентификации пар митотических хромосом или визуализации спаривания гомеологичных хромосом в мейозе [21,22]. Кроме того, применение GISH [23], позволило пометить в В. juncea хромосомы А или В. геномов. Многоцветный FISH с ДНК зондом и GISH маркер идентифицировал 28 хромосом этого вида.

В селекции с использованием интрогрессивной гибридизации рапса (B. napus) в основном используются тетраплоидные виды Brassica, которые содержат геном B (В. juncea и В. carinata ), потому что при слиянии родственных видов формирование жизнеспособного потомства, более вероятно, так как они имеют одинаковую плоидность [24]. Для выбора подходящего решения селекционных задач, связанных с использованием метода интрогрессивной гибридизации, требуется набор различных ДНК маркеров. В частности,  в  селекции  сурепицы  (B.  campestris),  овощных  форм  B.  rapa,  капусты  (B.oleracea) и рапса (B. napus) играют важную роль интрогрессия генетического материала В генома, который может нести гены контролирующие устойчивость к таким бактериальным и грибным заболеваниям, как фомоз, черная ножка рапса, сухая гниль капусты (Leptosphaeria maculans) [25,26] и сосудистый бактериоз (патоген Xanthomonas campestri spv. Campestris) [27], а также к засухе и повышенным температурам [28], осыпаемости семян [29]. Для того чтобы проследить передачу B генома, в наборе должны содержаться ДНК-маркеры, разбросанные равномерно по всем восьми хромосомам B генома. Маркеры участков хромосом или отдельных хромосом B генома, несущие гены хозяйственно полезных признаков, позволят провести детальный анализ, чтобы выявить результаты гибридизации и проследить перенос хозяйственно ценных признаков, если эти маркеры картированны  на хромосомах.

Вместе с тем, различные комбинации отдаленных гибридов возможно быстро перевести в гомозиготное состояние посредством культивирования изолированных микроспор. Именно для семейства Brassica данная технология широко и удачно используется. Преимуществом получения удвоенных гаплоидов в культуре изолированных микроспор является быстрое получение гомозиготного материала, который можно сразу оценивать на перспективность использования в селекционном процессе, поскольку в последующих поколениях при семенном размножении в потомстве не будет происходить расщепления по количественным и качественным признакам [30,31]. В Институте биологии и биотехнологии растений активно используется метод культуры изолированных микроспор [32]. Планируется с его помощью создание гомозиготных линий межвидовых гибридов. Кроме того, для определения жирнокислотного состава гибридных семян использовать методы хроматографии. С целью определения засухоустойчивости полученных линий будут использованы стандартные тест-методы.

В перспективе будут использованы GISH и FISH методы для характеристики изучаемого материала. Участники проекта планируют получить достаточно разнообразный гибридный материал рапса с сурепицей и горчицей, часть из которого будет переведена в гомозиготное состояние посредством культуры изолированных микроспор.

При проведении отдаленной гибридизации для повышения количества гибридных растеньиц будет использована культура изолированных зародышей и соответственно оптимизированы питательные среды культивирования. С целью получения гомозиготных линий межвидовых гибридов будет использована культура изолированных микроспор. Соответственно будут оптимизированы питательные среды и способы выделения, культивирования, регенерации и выращивания удвоенных гаплоидов полученных гибридов. Для характеристики отдаленных гибридов будет использованы GISH и FISH методы, а также молекулярные маркеры. Будет проведен соответствующий анализ проявления тех или иных признаков в зависимости от встроенных участков соответствующих геномов. Будут получены совершенно новые линии отдаленных гибридов для использования в создании новых сортов масличных культур пищевого направления для выращивания в условиях Северного Казахстана.

Планируемые эксперименты позволят повысить эффективность создания новых отечественных сортов. Значимость планируемых исследований заключается в том, что будут выяснены цитогенетические особенности создания межвидовых гибридов семейства Brassica. Будет определены оптимальные параметры при культивировании изолированных микроспор межвидовых гибридов. Анализ гибридов и дигаплоидных линий из них позволит выяснить роль отдельных хромосом геномов А, В и С в реализации количественных и качественных признаков. В результате реализации научных исследований будет получен ценный исходный материал для создания отечественных сортов рапса (канолы), который будет передан селекционерам.

Литература

1. Liu Y.B., Wei W., Ma K.P., Darmencya H. // Backcrosses to Brassica napus of hybrids between B. juncea and B. napus as a source of herbicide-resistant volunteer-like feral populations // Plant Science. – 2010. – V. 179. – P. 459–465.
2. Christopher James Schelfhout // DNA marker assisted breeding in interspecific crosses to improve canola (Brassica napus L.) // University of Western Australia. –
3. Sheikh F.A., Najeeb S., Rather A.G., Shashi Banga // Resynthesis of Ethiopian mustard (Brassica carinata L.) from related digenomic species: An unexplored possibility // American Journal of Agricultural Science Research. – 2014. – V. 1 (1). – P. 018-022.
4. Wen , Zhu L, Qi L., Ke H., Yi B., Shen J., Tu J., Ma C., Fu T. // Characterization of interploid hybrids from crosses between Brassica juncea and B. oleracea and the production of yellow-seeded B. napus // Theor Appl Genet. – 2012. – V. 125(1). – P. 19-32.
5. Weerakoon S.R. // Producing inter-specific hybrids between Brassica juncea (L.) czern & coss and B. oleracea (L.) to synthesize trigenomic (abc) Brassica // J Sci. Univ. Kelaniya. – 2011. – V. 6. – P. 13-34.
6. Iqbal M., Akhtar N., Zafar S., Ali I.// Genotypic responses for yield and seed oil quality of two Brassica species under semi-arid environmental conditions // South African Journal of Botany. – 2008. – V. 74. – P. 567–571.
7. M.C.M. Iqbal, S. R. Weerakoon, P.K.D. Peiris // Variability of fatty acid composition in interspecific hybrids of mustard Brassica juncea and Brassica napus // Cey. J. Sci. (Bio. Sci.). – 2006. – V. 35 (1). – P. 17-23.
8. Singh V.V., Rai P.K., Siddiqui S.A., Verma V., Rajbir Yadav // Genetic variability and relative drought tolerance in interspecific progenies of Brassica juncea // Agric. Biol. J. N. Am. – 2011. – V.2(1). – P. 34-41.
9. Lukens Lewis , Pires J. Chis, Leon Enrique, Vogelzang Robert, Oslach Lynne, Osborn Thomas // Patterns of sequence loss and cytosine methylation within a population of newly resynthesized Brassica napus allopolyploids // Plant Physiol. – 2006. – V. 140. – P. 336-348.
10. Nagaharu U.// Genome analysis in Brassica with special reference to the experimental formation of B. napus and peculiar mode of fertilization // Japan Journal of Botany. – 1935. – 9. – P. 389 – 452.
11. Chevre A.M., Ebcr F., This P., Barret P., Tanguy X., Brun H., Delseny M., Rcnard M. // Characterization of Brassica nigra chromosomes and of blackleg resistance in B. napus-B. nigra addition lines // Plant Breed. – 1996. – V. 115. – P. 113-118.
12. Struss D., Quiros C.F., Plieske J., Robbelen G. // Construction of Brassica B-genome synteny groups based on chromosomes extracted from three different sources by phenotypic, isozyme and molecular markers // Theor Appl Genet. – 1996. – V. 93. – P. 1026-1032.
13. Friedt Wolfgang, Liihs Wilfried // Recent developments and perspectives of industrial rapeseed breeding // Fat-Lipid. – 1998. – V. 100. – P. 219-226
14. Glimelius К. // Somatic hybridization. In: Gomez-Campo C, ed. Biology of Brassica coenospecies // Amsterdam: Elsevier Science. – 1999. – P. 07-148.
15. Maluszynska J., Heslop-Harrison P. // Physical mapping of rDNA loci in Brassica species // Genome. – 1993. – V. 36. – P. 774-781.
16. Snowdon R.J., Kohler W., Kohler A. // Chromosomal localization and characterization of rDNA loci in the Brassica A and С genomes. // Genome. – 1997. – V. 40. – P. 582-587.
17. Fukui К., Nakayama , Ohmido N., Yoshiaki H., Yamabe M. // Quantitative karyotyping of three diploid Brassica species by imaging methods and localization of 45S rDNA loci on the identified chromosomes // Theor Appl Genet. – 1998. – V. 96. – P.325-330.
18. Hasterok Robert, Jenkins Glyn M., Langdon Tim, Jones R. Neil, Maluszynska J: Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes // Theor Appl Genet. – 2001. – V. 103. – P. 486-490.
19. Moscone A., Matzke M.A., Matzke A.J.M // The use of combined FISH/GISH in conjunction with DAPI counterstaining to identify chromosomes containing transgene inserts in amphidiploid tobacco // Chromosoma. – 1996. – V. 105. – P. 231-236.
20. Lim Y., Matyasek R., Lichtenstein C.P., Leitch A.R. // Molecular cytogenetic analyses and phylogenetic studies in the Nicotiana section Tomentosae // Chromosome. – 2000. – V.109. – P. 245-258.
21. Abbasi M., Brar D.S., Carpena A.L., Fukui K., Khush G.S. // Detection of autosyndetic and allosyndetic pairing among A and E genomes of Oryza through genomic in situ hybridization// RGN. – 1999. – V. 16. – P. 24-25.
22. Cao , Sleper D.A., Dong F., Jiang J. // Genomic in situ hybridization (GISH) reveals high chromosome pairing affinity between Lolium perenne and Festuca mairei // Genome. – 2000.– V. 43. – P.398-403.
23. Maluszynska J., Hasterok R. // Identification of individual chromosomes and parental genomes in Brassica juncea using GISH and FISH // Cytogenet. Genome Res. – 2005. –V. 109. – P. 310-314.
24. Warwick I., Gugel R.K., McDonald T., Falk K.C. // Genetic variation of Ethiopian mustard (Brassica carinata A. Braun) germplasm in Western Canada. // Genet. Resour. Crop Evol.–2006. –V. 53. – P. 297-312.
25. Christianson A., Rimmer S.R., Good A.G., Lydiate D.J. // Mapping genes for resistance to Leptosphaeria maculans in Brassica juncea // Genome. – 2006. –V. 49. –P. 30-41.
26. Delourme R., Chevre A.M., Brun H., Rouxel T., Balesdent M.H., Dias J., Salisbury , Renard M., Rimmer S.R. // Major gene and polygenic resistance to Leptosphaeria maculans in oilseed rape (Brassica napus) // Eur. J. Plant Pathol. – 2006. – V. 114. – P. 41-52.
27. Vicente G., Taylor J.D., Sharpe A.G., Parkin I.A.P., Lydiate D.J., King G.J. // Inheritance of race-specific resistance to Xanthomonas campestris pv. campestris in Brassica genomes // Phytopathology. – 2002. – V.92. – P. 1134-1141.
28. Kumar , Singh P., Singh D.P., Singh H., Sharma H.C. // Differences in osmoregulation in Brassica species // Annals of Botany. – 1984. – V.54. – P.537-541.
29. Prakash Shyam, Chopra L. // Introgression of resistance to shattering in Brassica napus from Brassica juncea through non-homologous recombination // Plant Breed. – 1988. – V. 101. – P. 167-168.
30. Matthew Nelson, Annaliese A.S. Mason, Marie-Claire Castello, Linda Thomson, Guijun Yan, Wallace A. // Cowling Microspore culture preferentially selects unreduced (2n) gametes from an interspecific hybrid of Brassica napus L. x Brassica carinata Braun // Theor Appl Genet. – 2009. – V.119. – P.497–505.
31. Zhang G.Q., He Y., Xu L., Tang G.X., Zhou W.J.// Genetic analyses of agronomic and seed quality traits of doubled haploid population in Brassica napus through microspore culture // – 2006. – V.149. – P.169–177.
32. 31.Жамбакин К.Ж., Шамекова М.Х., Волков Д.В., Затыбеков А.К., Дауров Д.Л., Жорабекова А.К., Халиков А.Р. Получение удвоенных гаплоидов рапса // «Вестник», КазНУ. – Алматы. – 2012 г. - № 5 (35). – С. 47-57.