Сравнительные результаты иммуногистохимических исследований клеточного состава тимуса крупного рогатого скота

С помощью гистологических и иммуногистохимических методов с использованием Polyclonal Rabbit Anti-Human T cell, CD 3, Monoclonal Mouse Anti-Human Myeloid/Histocyte Antigen, Clone MAC 387 и Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen, Clone PC10 антисывороток, были выявлены и демонстрированы места локализации Т- лимфоцитов, макрофагов и митоза лимфоидных клеток в парафиновых срезах тимуса крупного рогатого скота, фиксированное в формалине. 

Введение

По исследованию вопросов морфологии тимуса крупного рогатого скота в странах СНГ имеется ряд научных  работ [1-4].

Гатин И.М. (1990) исследовал морфогенез и клеточный состав тимуса у бычков разного возраста при откорме в индивидуальном секторе и в промышленных условиях. Состав и соотношение клеточных элементов тимуса бычков при откорме в индивидуальном секторе отражают антигеннезависимые изменения. Морфология тимуса 16-месячных бычков при откорме в промышленных условиях характеризуется большим разнообразием клеток, наличием значительного числа гранулоцитов, тканевых базофилов с выраженной деградацией, резким огрубением ретикулярных волокон стромы, мукоидным набуханием стенок сосудов микроциркуляторного русла. Выявленные изменения являются морфологическим эквивалентом возникновения аллергических реакций гиперчувствительности замедленного типа [1].

Применение кормовой добавки препарата "Привес-40" нормализовало морфологию тимуса, т.е. соотношение лимфоидных клеток коркового и мозгового вещества в сторону увеличения их количества в коре долек тимуса. При этом произошло снижение содержания эозинофильных гранулоцитов и тканевых базофилов.

Фомина Н.М. (1990) исследовала возрастную морфологию лимфоидных органов,  в том числе тимуса у крупного рогатого скота в зависимости от различной степени двигательной активности [2].

У новорожденных телочек тимус имеет значительно развитую лимфоидную ткань, которая хорошо дифференцирована на корковое и мозговое вещество. Корковое вещество занимает большую площадь, чем мозговое. Тимус за период от новорожденного до девятимесячного возраста меняет свою топографию. Цвет органа изменяется от бледно- розового у новорожденных до серо-розового у 9 месячных, его консистенция с возрастом уплотняется. Форма тимуса становится лентовидной. В условиях гиподинамии тимусу характерна более ранняя возрастная регрессия. Этот процесс начинается у телят с 4 месячного возраста и отчетливо прослеживается к 9 месяцам, а у телят, получавших дозированное принудительное движение, признаков возрастной регрессии еще нет.

Сабирова Э.С. (2009) изучала строение и иннервацию тимуса крупного рогатого скота холмогорской породы в онтогенезе. По ее данным во всех исследованных этапах (плоды 5-8 - месячного возраста, новорожденные, 2-, 4 - месячные телята, 2 - летние животные) развития органа, тимус холмогорской породы имеет непарную грудную и парные шейные доли. Грудная доля располагается в предсердном средостении, а шейные тянутся вдоль трахеи по обе стороны, топография которых в возрастном аспекте не претерпевает значительных изменений. В постнатальном онтогенезе (у новорожденных, 2-, 4 - месячных телят,  2 - летних животных) изменение абсолютной массы тимуса неравномерное: у новорожденных телят - 152,64 ± 10,42 г., у 2- месячных телят - 113,11 ± 6,60 г., у 4 - месячных телят - 121,93 ± 5,92 г., у 2 - летних животных - 244,84 ± 9,87г., а относительная масса органа неукоснительно снижается с 0,56 у новорожденных до 0,06 у 2 - летних животных. К 2 - летнему возрасту у животных происходит замещение части рабочей паренхимы на жировую ткань. При выраженной возрастной инволюции в дольках тимуса обнаруживаются кровеносные сосуды, с хорошо развитыми стенками и большое количество тимусных телец [3].

Фисенко С.П. (2010) с помощью морфологических и морфометрических исследований изучала динамику интенсивности роста и возрастные морфологические изменения тимуса телят черно-пестрой породы от рождения до восьмимесячного возраста. По ее данным тимус телят крупного рогатого скота представлен анатомически сформированным органом, состоящим из двух отделов — грудного и шейного и имеющим светло-серый цвет с розоватым оттенком [4].

Изучение гистологических изменений в тимусе телят в возрастном аспекте показало: период от рождения до семи месяцев постнатальной жизни характеризуется быстрым увеличением массы и объема железистой ткани, стабилизацией структуры, преобладанием коркового вещества над мозговым, возрастанием количества долек, увеличением  плотности и усилением митоза тимоцитов в подкалсулярной зоне коры, количественным и качественным многообразием тимусных телец. Тимус в указанный период достигает максимального развития, что соответствует его высокой функциональной значимости как органа лимфоэпителиальной системы. Начиная с восьмимесячного возраста в тимусе появляются первые признаки инволютивных явлений: появление жировых клеток в соединительнотканых элементах железы, преобладание мозгового вещества над корковым, уменьшение плотности расположения клеток мозговой зоны и снижение митотической активности клеток корковой.

В научных трудах вышеуказанных авторов исследованы макроморфология, морфометрия, топографическая анатомия, клеточный состав тимуса на основе гистологических исследований в зависимости от возраста и условий содержания и отсутствуют исследования, посвященные дифференцировке   популяции иммунокомпетентных клеток в тимусе.

Сегодня в развитых странах мира в гуманитарной и ветеринарной медицине морфологами и патологами широко применяются иммуногистохимические методы,  которые дают возможность дифференцировать исследуемые клетки и показать их непосредственно в гистосрезах.

На сегодня поли- и моноклональные антитела, используемые для дифференцировки поверхностных маркеров лейкоцитов человека и пролиферации клеток, применяются в экспериментальной биомедицине, ветеринарной медицине для выявления лейкоцитов экспериментальных, домашних и диких животных [5-10].

Цель настоящей работы заключается в выявлении и демонстрации в парафиновых гистосрезах, фиксированных в формалине, структуры и клеточного состава тимуса крупного рогатого скота с помощью гистологических и иммуногистохимических методов.

Материалы и методы исследования

Работа выполнялась на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы, гистологии и патологии факультета ветеринарной медицины и биотехнологии  Кыргызского национального аграрного университета им. К.И. Скрябина и в лаборатории иммуногистохимии и гематологии института ветеринарной патологии факультета ветеринарной медицины Гиссенского Университета (Гиссен, Германия, руководитель института - профессор Манфред Рейнахер).

После забоя 7 голов крупного рогатого скота в возрасте от 1,5 до 7 лет в убойных пунктах городов Ош и Бишкек все органы забитых животных были подвергнуты детальному осмотру для исключения каких-либо патологии в органах. При исследовании в тимусе отсутствовали макроскопические и гистологические изменения.

Объектом исследования служил тимус. Гистологическому исследованию подвергнуты все 7 голов крупного рогатого скота,  а  иммуногистохимическому исследованию 3 головы.

Кусочки от тимуса после детального осмотра были зафиксированы  в  10%-ном водном растворе нейтрального формалина в соответствии с методикой. После фиксации дальнейшая гистологическая процедура (обезвоживание и заключение в парафин кусочков) производилась в обычных лабораторных условиях (вручную) и в специальной машине в вакууме (автоматически). Из парафиновых блоков готовились серийные срезы на санном микротоме толщиной 4-6 мкм и на микротоме новой модификации толщиной 2-3 мкм. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином для описания и анализа общей гистокартины тимуса, селезенки и лимфатических узлов.

При иммуногистохимическом исследовании был использован РАР (peroxidase- antiperoxidase complex) метод для выявления Т-лимфоцитов, макрофагов и пролиферации клеток. Для выявления Т-лимфоцитов использовали антисыворотку Polyclonal Rabbit Anti- Human T cell, CD 3. Code No. A. 0452, (PAP); макрофагов – антисыворотку Monoclonal Mouse Anti-Human Myeloid/Histocyte Antigen, Clone MAC 387. Code Nr. M0747 (PAP); пролиферацию клеток - антисыворотку Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen, Clone PC10. Code-Nr. M 0879 (PAP). При положительной реакции CD 3 положительные клетки (Т- лимфоциты), клетки в состоянии пролиферации окрашивались в коричневый цвет,  MAC 387 положительные клетки (макрофаги) – в темно-коричневый цвет.

Результаты исследований

Гистологически тимус крупного рогатого состоит из капсулы, междольковых перегородок и паренхимы. В паренхиме тимуса крупного рогатого скота в возрасте 1,5 лет имеются дольки, в которых четко дифференцированы корковое и мозговое вещество. Между дольками тимуса можно наблюдать наличие жировой ткани. В корковом веществе тимоциты располагаются густо, особенно, в подкапсулярной зоне. Из-за рыхлого расположения лимфоцитов, мозговое вещество выделяется светлой окраской. В мозговом веществе, помимо тимоцитов и макрофагов, выделяются тимусные тельца или тельца Гассаля (Рисунок 1а).

Парафиновые срезы тимуса крупного рогатого скота.

Рисунок 1 - Парафиновые срезы тимуса крупного рогатого скота. 

Окраска гематоксилином и эозином. а. Активное морфофункциональное состояние тимуса с началом процесса инволюции. Четко выражено корковое и мозговое вещество тимуса. Небольшая часть паренхимы замещена жировой тканью. Возраст – 1,5 лет. bar=200µm; б. Выраженная возрастная инволюция тимуса. Отсутствует корковое вещество долек тимуса. Возраст – 7 лет. bar=100µm.

При сравнительном исследовании тимусных телец, можно выделить одноклеточные, мелкие и крупные слоистые тельца, а также слоистые тельца с кистозным перерождением. Тимус у крупного рогатого скота старшего возраста подвержен выраженной возрастной инволюции, которая на гистологических срезах характеризуется наличием большого количества жировой ткани, уменьшением площади паренхимы тимуса. В дольках тимуса отсутствуют корковое вещество. В отдельных местах паренхима тимуса полностью замещена жировой тканью (Рисунок 1 б).

Иммуногистохимические исследования парафиновых срезов тимуса крупного рогатого скота разных возрастов показали следующие результаты:

В тимусе крупного рогатого скота в возрасте 1,5 лет Т- лимфоциты в большом количестве расположены в корковом веществе и умеренно в мозговом веществе (Рисунок 2 а).

Макрофаги расположены в междольковых перегородках, вокруг сосудов, в  корковом и мозговом веществе, но в мозговом веществе количество макрофагов преобладает (Рисунок 3а).

В корковом и мозговом веществе тимуса, особенно в подкапсулярной зоне коркового вещества, отмечена интенсивная  пролиферация тимобластов (Рисунок 4а).

Иммуногистохимическое выявление  Т-лимфоцитов в тимусе. РАР метод. а.

Рисунок 2 - Иммуногистохимическое выявление  Т-лимфоцитов в тимусе. РАР метод. а. 

Масса Т-лимфоцитов в корковом веществе тимуса при его активном морфофункциональном состоянии. Возраст – 1,5 лет. bar=100µm.; б. Наличие Т-лимфоцитов только в мозговом веществе тимуса его при выраженной инволюции. Возраст – 7 лет. bar=100µm.

Иммуногистохимическое выявление макрофагов. РАР метод. а.

Рисунок - 3. Иммуногистохимическое выявление макрофагов. РАР метод. а.

Макрофаги в паренхиме тимуса. Возраст – 1,5 лет. bar=200µm; б. Увеличение макрофагов в паренхиме тимуса при ее выраженной возрастной инволюции. Возраст – 7 лет. bar=100µm.

В тимусе крупного рогатого скота в возрасте 7 лет при выраженной возрастной инволюции Т- лимфоциты располагаются только в мозговом веществе (Рис. 2б), увеличено количество макрофагов, особенно в мозговом веществе (Рис. 3б), выявлена слабая пролиферация клеток в мозговом веществе (Рис. 4б).

Иммуногистохимическое выявление пролиферации лимфоидных    клеток.РАР метод.

Рисунок - 4. а. Иммуногистохимическое выявление пролиферации лимфоидных    клеток.РАР метод.

Интенсивная пролиферация лимфоидных клеток в корковом и мозговом веществе тимуса при ее активном морфофункциональном состоянии. Возраст  – 1,5 лет.   bar=200µm; б. Ослабление митотической активности долек тимуса при выраженной его инволюции. Возраст – 7 лет. bar=100µm. 

Выводы

Результаты проведенных гистологических и иммуногистохимических исследований позволяют нам сделать следующие выводы:

  1. Исследован клеточный состав тимуса крупного рогатого скота в активном морфофункциональном состоянии и при возрастной инволюции.
  2. Установлено, что Polyclonal Rabbit Anti-Human T cell, CD 3 антисыворотку можно использовать для выявления Т-лимфоцитов, Monoclonal Mouse Anti-Human Myeloid/Histocyte Antigen, Clone MAC 387 антисыворотку – для выявления макрофагов, а Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen, Clone PC10 – для выявления пролиферирующих клеток в парафиновых срезах тимуса крупного рогатого скота, фиксированные в формалине.
  3. Вышеуказанные поли- и моноклональные антитела в дальнейшем можно использовать при исследовании нормы и патологии тимуса крупного рогатого скота.
  4. Впервые демонстрированы   и   показаны    места    локализации   Т-лимфоцитов, макрофагов и митоза лимфоидных клеток в тимусе в активном морфофункциональном состоянии и при возрастной инволюции.

 

Литература

  1. Гатин И. М. Биоморфология тимуса и селезенки крупного рогатого скота при откорме / Автореф. дис…. канд. вет. наук 16.00.02. – Казань, – 20 с.
  2. Фомина Н.М. Возрастная морфология лимфоидных органов у крупного рогатого скота в зависимости от различной степени двигательной активности / Автореф. дис… канд. биол. наук. 00.02. –Москва, 1990. – 20 с.
  3. Сабирова Э.С. Особенности строения и иннервации тимуса крупного рогатого скота холмогорской породы в онтогенезе/ Автореф. дис…. канд. биол. наук 16.00.02. – Казань, 2009. -22 с.
  4. Фисенко С.П. Морфологическая характеристика щитовидной железы и тимуса молодняка крупного рогатого скота черно-пестрой породы/ Автореф. дис….. канд. биол. наук 06.02.01. – Саранск, 2010. – 20 с.
  5. Mackay C. Sheep leukocyte molecules: a review of their distribution, structure and possible function. Vet. Immunol. Immunopathol. 1988. – 19. –p. 1-20.
  6. Иргашев А.Ш., Алдаяров Н.С. Демонстрация иммунокомпетентных клеток в периферических органах иммуногенеза у клинически здоровых собак // Вестник КАУ,№ 2(6), Бишкек, 2006. С. 85-89.
  7. Иргашев А.Ш., Асанова Э.И., Manfred R. Выявление иммунокомпетентных клеток в лимфатических узлах яка// Вестник КАУ, № 1(7), Бишкек, 2007. -С. 165 –
  8. Иргашев А.Ш., Асанова Э.И., Manfred R. Иммуноморфология селезенки яка // Исследования, результаты, № 3, 2 –С. 105 – 108.
  9. Марасулов А.А., Алдаяров Н.С., Иргашев А.Ш. Возрастная морфология тимуса у домашних кроликов //Вестник Кыргызского национального аграрного университета. –№ 4 (15). - С. 162-168.
  10. Irgashev , Mitrofanov B., Arbaev K., Gutberlet K., Rudolph R.. Demonstration of T- and B- lymphocytes and proliferative cells in formalin-fixed paraffin embedded thymus, lymph nodes and spleen of clinically healthy sheep.// Материалы 1-международного ветеринарного конгресса, Алматы, 2002. –С. 108-110.
Фамилия автора: Г. К. Касиева, А.Ш. Иргашев, Ж.И. Казиев, М. Рейнахер
Год: 2014
Город: Алматы
Яндекс.Метрика