Другие статьи

Цель нашей работы - изучение аминокислотного и минерального состава травы чертополоха поникшего
2010

Слово «этика» произошло от греческого «ethos», что в переводе означает обычай, нрав. Нравы и обычаи наших предков и составляли их нравственность, общепринятые нормы поведения.
2010

Артериальная гипертензия (АГ) является важнейшей медико-социальной проблемой. У 30% взрослого населения развитых стран мира определяется повышенный уровень артериального давления (АД) и у 12-15 % - наблюдается стойкая артериальная гипертензия
2010

Целью нашего исследования явилось определение эффективности применения препарата «Гинолакт» для лечения ВД у беременных.
2010

Целью нашего исследования явилось изучение эффективности и безопасности препарата лазолван 30мг у амбулаторных больных с ХОБЛ.
2010

Деформирующий остеоартроз (ДОА) в настоящее время является наиболее распространенным дегенеративно-дистрофическим заболеванием суставов, которым страдают не менее 20% населения земного шара.
2010

Целью работы явилась оценка анальгетической эффективности препарата Кетанов (кеторолак трометамин), у хирургических больных в послеоперационном периоде и возможности уменьшения использования наркотических анальгетиков.
2010

Для более объективного подтверждения мембранно-стабилизирующего влияния карбамезапина и ламиктала нами оценивались перекисная и механическая стойкости эритроцитов у больных эпилепсией
2010

Нами было проведено клинико-нейропсихологическое обследование 250 больных с ХИСФ (работающих в фосфорном производстве Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции)
2010


C использованием разработанных алгоритмов и моделей был произведен анализ ситуации в системе здравоохранения биогеохимической провинции. Рассчитаны интегрированные показатели здоровья
2010

Специфические особенности Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции связаны с производством фосфорных минеральных удобрений.
2010

Разработка иммуноферментного анализа для диагностики c. Perfringens

Получены очищенные антигены возбудителя C. perfringens по методу Grasset и кипячения, активность у которых в РДП составила 1:8-1:16 и 1:16-1:32 соответственно. Активная специфическая сыворотка к возбудителю C. perfringens получена на кроликах, активность в РДП составила 1:16 и 1:32, а в ИФА 1:800-1:3200. Для иммунизации кроликов использованы антигены приготовленной по методу кипячения. Специфическая сыворотка к возбудителю C. perfringensв опыте использованы для выделения иммуноглобулина и приготовления конъюгата. На основе приготовленных диагностических препаратов был разработан метод иммуноферментного анализа (ИФА), пригоден для диагностики возбудителя C. perfringens

Введение

В связи с развитием клеточных технологий, молекулярной биологии, генетики, физики, химии и ряда других высокотехнологичных дисциплин в повседневную практику внедряются новые высокоточные и высокотехнологичные методы. Данные междисциплинарные тенденции затрагивают и область ветеринарных знаний, и смежные области биологических, биохимических проблем. Широкое  распространение и внедрение в массовую практику получил метод лабораторной диагностики под названием иммуноферментный анализ [1].

ИФА - это лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов, а также иммуноглобулинов и гормонов.

Метод ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью, которая в настоящее время составляет более 90%.

Метод ИФА дает возможность определения антител (IgG, IgA, IgM) к возбудителям инфекции в крови. Эти антитела вырабатываются организмом в ответ на инфицирование. Антитела выявляются при взаимодействии со специальными препаратами, содержащими соответствующие антигены, образующие с антителами прочный комплекс, который можно обнаружить разными способами [2].

В основе метода лежит принцип взаимодействия иммуносорбента — антигена возбудителя инфекции с выявляемыми антителами [3].

Таким образом, за счет несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счет автоматизации учета результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики [4-7].

Достоинства ИФА — возможность ранней диагностики инфекции, возможность прослеживать динамику развития процесса, быстрота и удобство в работе.

Недостаток ИФА — относясь к непрямым методам диагностики, он позволяет определить иммунный ответ организма на возбудителя, а не сам возбудитель [8].

ИФА широко используется для диагностики всевозможных инфекций (хламидиоз, токсоплазмоз и др.), как острых, так и хронических, а также скрытых форм, которые протекают без клинических симптомов.Также этот метод применяют для контроля над хроническими заболеваниями [9, 10].

В связи с этим, цель данной работы проведение исследований по разработки условий постановки ИФА для диагностики C. perfringens.

Так как последние 5 лет на территории Республики Казахстан данная инфекция часто поражает домашних и в том числе диких животных [11].

Материалы и методы

Возбудитель. В работе использовали штамм Clostridium/Saigas/2010/ZKO/KZ возбудителя C. perfringens, выделенный от павшего сайгака из Западно-Казахстанской области в 2010 г.

Специфические иммуноглобулины  к  антигену             штамма Clostridium/Saigas/2010/ZKO/KZ возбудителя C. perfringens из антисывороток выделяли спиртовым методом по Кону [12].

Специфические конъюгаты получали по методу Wilson и Nakane [13]. В работе использовали пероксидазу хрена фирмы "Сигма" (США) типа VI-А. Подбирали оптимальное рабочее разведение коньюгата, дающее максимальную цветовую реакцию при внесении его в планшеты с антигеном.

Для проверки специфичности тест-системы ТФ-ИФА использовали культуральные антигены из штамма Clostridium/Saigas/2010/ZKO/KZ возбудителя C. perfringens, бульонную суспензию возбудителя C. perfringens, нормальный культуральный антиген, гетерогенные специфические антигены (возбудителя E.coli, Y.enterocolitica 842, Y.pseudotuberculosis 2841).

Концентрацию белка в антигенах из штамма Clostridium/Saigas/2010/ZKO/KZ возбудителя C. perfringens определяли с помощью спектрофотометра BoecoS-30 по методу Лоури [14].

При подборе наиболее чувствительных полистироловых планшетов для постановки ИФА при возбудителе C. perfringens были испытаны планшеты следующих фирм-производителей:   «Costar»   (США),   «Nunc»,   DenmarkF,   maxiSorpF     (Дания), «Союзмедполимер», Москва и Ленинград (Россия), Labsystems Finland, Linbro/Titertek (США), Италия.

При отработке оптимальных условий постановки ИФА были испытаны различные буферные растворы для разбавления компонентов реакции, а также временные и температурные условия экспозиции иммуноглобулина, антигенов, и конъюгата.

Учет результатов ИФА проводили на фотометре марки «MultiskanPlus» при длине волны 405 нм. Результат считали положительным, если оптическая плотность испытуемого антигена в два и более раза превышала оптическую плотность нормального антигена.

Результаты исследований

Известно, что метод ИФА применяют для диагностики бактериальных и вирусных инфекций во многих странах. Однако методы ИФА отличаются между собой  по многим параметрам и имеют специфические особенности.

Для получения активных и специфичных антисывороток к возбудителю C. perfringens необходимо было подобрать методы очистки и концентрирования антигена из биомассы.

Для приготовления антигена C. perfringens были испытаны 2 способа очистки наработанной и инактивированной бактериальной массы. 1 способ – по методу Grаsset[15]. 2  способ – по методу кипячения [16-18].

Активность в РДП антигенов, очищенных по первому способу, составила 1:8-1:16, по второму способу 1:16-1:32, а концентрация белка в приготовленных антигенах к возбудителю  C.  perfringens  по  методу  Grassetсоставила  17,2  мг/мл,  а  по       методу кипячения 204,9 мг/мл. Наиболее активные и специфичные антисыворотки  получены на кроликах, с использованием антигена приготовленного по методу кипячения, активность которых составили в РДП 1:16 и 1:32 и в ИФА 1:800-1:3200 соответственно. Из полученных антисывороток выделены вирусспецифические иммуноглобулины с использованием спиртового метода по Кону[13]. Активность иммуноглобулина выделены  по методу Кона составила в РДП – 1:32.

На основе выделенного иммуноглобулина приготовлены вирус специфический иммунопероксидазный конъюгат [13]. Рабочая активность конъюгата в ИФА составила – 1:50. Конструирование      иммуноферментной      тест-системы       включает подбор оптимальных параметров постановки реакции, от которых зависят чувствительность   и специфичность разрабатываемой тест-системы.

Оптимальную сенсибилизирующую дозу иммуноглобулинов определяли в опыте “шахматного титрования” со специфическими и нормальными антигенами. Специфический иммуноглобулин испытывали в разведениях от 1:100 до 1:12800.

Предельный титр иммуноглобулина, который позволяет выявить специфический антиген штамма Clostridium/Saigas/2010/ZKO/KZвозбудителя C. perfringensв его максимальном титре, составил 1:1600, а рабочее разведение 1:100. Исходя из этого, в дальнейшем для сенсибилизации использовали данную дозу специфического иммуноглобулина.

С целью снижения неспецифических реакций были испытаны различные концентрации бычьего сывороточного альбумина (БСА), а также различные буферные растворы для ресуспендирования антигенов, конъюгата, и в качестве промывочного раствора. Были исследованы концентрации БСА 0,1%, 0,5%, 1%, 2%. Исследования, проведенные в этом направлении, позволили установить, что блокирование свободных центров связывания на планшете целесообразно проводить 1% раствором БСА на фосфатно-солевом буфере с рН 7,4 с добавлением 0,1% Твин-80.

Для определения оптимальной концентрации приготовленного иммуно пероксидазного конъюгата при проведении ТФ-ИФА подбирали его оптимальное рабочее разведение, дающее максимальную цветовую реакцию при внесении в полистироловые планшеты. Предельным титром иммунопероксидазного конъюгата считали его максимальное разведение, которое способно выявить специфический антиген штамма Clostridium/Saigas/2010/ZKO/KZ возбудителя C.perfringens, при отрицательном результате с нормальным антигенам. Конъюгат исследовали в разведениях от 1:50 до 1:12800. За оптимальное рабочее разведение конъюгата принимали его восьмикратный предельный титр, который составил – 1:50.

При оптимизации условий постановки ИФА также были испытаны сорбционные свойства твёрдой фазы, в качестве которой использовали 96-луночные планшеты для ИФА. С этой целью проводили титрование иммуноглобулинов в планшетах различных производителей. В результате проведенных опытов установлено, что максимальной способностью сорбировать иммуноглобулин с однородностью сорбции обладают планшеты фирмы LabsystemsFinland и Costar. Другие испытанные планшеты обладали меньшей сорбционной способностью и однородностью сорбции.

С использованием подобранных оптимальных параметров постановки ИФА были проведены исследования по определению специфичности и чувствительности разработанной тест-системы.

Результаты исследований по применению отработанного ИФА для    диагностики

  1. perfringens представлены в таблице 

Таблица 1 - Результаты постановки ИФА по выявлению возбудителя C.рerfringens

 Результаты постановки ИФА по выявлению возбудителя C.рerfringens 

Из данных таблицы 1 видно, что разработанный ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Антигены возбудителя C. perfringensвыявлены в культуральных пробах в титрах 1:32-1:2048. Все нормальные и гетерологичные пробы показали отрицательные результаты в ИФА.

Специфичность, эффективность и пригодность разработанной ИФА тест-системы были проверены при исследований биоматериалов, взятых от павших архара и жирафа из Алматинского зоопарка.

В ходе исследований проб получены следующие результаты, которые указаны в таблице 2. 

Таблица 2 – Результаты исследований биоматериалов

  Результаты исследований биоматериалов

В ходе исследовании, установлены, что в двух пробах исследованных 6-ти пробах архара и 7-и пробах исследованных 8-и пробах жирафа были выявлены антиген возбудителя C. perfringens. Полученные данные подтверждены с помощью методами полимеразной цепной реакции и реакции диффузионной преципитации.  Таким образом, разработанный метод ИФА апробированы при проведении экспертизы культуральных и полевых проб возбудителя C. perfringens.

Заключение

В результате проведенных исследований, с применением концентрированных и очищенных препаратов антигенов C. perfringens, приготовленных по второму способу, получены активные и специфичные антисыворотки против C. perfringensна    кроликах.

На основе данных антисывороток приготовлены диагностические препараты для метода ТФ-ИФА.

Установлены оптимальные параметры и условия постановки разработанного теста: сенсибилизация лунок планшетов фирм Labsystems Finland или Costar иммуноглобулинами в разведении 1:100, ресуспендированных 0,15М физиологическом буфере рН 7,2, блокирование свободных сайтов связывания 1% раствором БСА в буферном растворе, время экспозиции иммуноглобулина с лунками планшета – 18ч при 4°С или 3 ч при 37°С, время экспозиции антигенов с иммуноглобулином 18ч при 4°С или 3 ч при 37°С, время инкубирования иммунопероксидазного конъюгата с антигеном на иммуносорбенте 60 мин (±5) при 37°С.

В результате проведенных испытаний установлены высокая специфичность и чувствительность тест-системы при исследовании антигенов возбудителя  C. perfringens, что свидетельствует о её пригодности для диагностики данного возбудителя.

 

Литература 

  1. Иммуноферментный анализ / Редакция Т.Т. Нго, Г. Ленхофф. М.: Мир,
  2. Егоров А. М., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е. М. Теория и практика иммуноферментного анализа. 1991, Москва: Высшаяшкола.
  3. Tijssen , Practice and theory of enzyme immunoassays. 1985, Amsterdam; New York: Elsevier ; New York, USA : Sole distributors for the USA and Canada, Elsevier Science Pub. Co. 502.
  4. Абелев Г.И. Основа иммунитета // Соросовский Образовательный журнал. 1996. №5. С.4-10.
  5. Галактионов В.Г. Как работает иммунная система // Там же. 1997. №12. С.2-9. 6 Абелев Г.И. Моноклональные антитела // Там же. 1998. №1. С.16-20.
  6. Березин И.В. и др. Биотехнология / Ред. Н.С. Егоров, В.Д. Самуилов. М.: Высшая школа, 1987. Кн.8: Инженерная энзимология.
  7. Егоров А.М. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш.Шк., 1991.
  8. Dwyer R.St.C. Chlamydial infection. Results of micro-immunofluorescence tests for the detection of type-specific antibody in certain chlamydial infections // Brit. J. Vener. Dis. - 1972. - Vol. 48. - P. 452-459.
  9. Hill , Dubey J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention // Clin. Microbiol.Infect. 2002. № 10.
  10. Орынбаев М. Б., Рыстаева Р. А., Керимбаев А.А., Копеев С.К., Коспанова М, Н., Кыдырбаев Ж.К. Случаи массовой гибели уральской популяции сайгаков в Казахстане//Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 1 (17), 03. 2013 г. Санкт-Петербург С. 20-26
  11. Фримель Г. Иммунологические методы. М: «Медицина», 1987. - 472 с.
  12. Wilson M.B., Nakane P.K. Resent development in the periodate method of conjugating horseradish peroxides (HRPO) to antibodies // Biomedical press. 1978. - PР. 215- 244.
  13. Lowry H., Rosebrough N.I., Farr A.L. et al. // J. biol. Chem. - 1951. - v. 193, P.265-275.
  14. Grasset E. - C.R.Soc.Biol. 1935.v.118. 765 p.
  15. Быченко Б. Д.- Журнал микробиология. - №2. - С. 131-135.
  16. Гусев А.И., Цветков В.С. Лабораторное дело.- - № 2.- С. 43-45.
  17. Матвеев К.И.- Журнал микробиология.- - № 10-11.- С. 37-40.

Разделы знаний

Архитектура

Научные статьи по Архитектуре

Биология

Научные статьи по биологии 

Военное дело

Научные статьи по военному делу

Востоковедение

Научные статьи по востоковедению

География

Научные статьи по географии

Журналистика

Научные статьи по журналистике

Инженерное дело

Научные статьи по инженерному делу

Информатика

Научные статьи по информатике

История

Научные статьи по истории, историографии, источниковедению, международным отношениям и пр.

Культурология

Научные статьи по культурологии

Литература

Литература. Литературоведение. Анализ произведений русской, казахской и зарубежной литературы. В данном разделе вы можете найти анализ рассказов Мухтара Ауэзова, описание творческой деятельности Уильяма Шекспира, анализ взглядов исследователей детского фольклора.  

Математика

Научные статьи о математике

Медицина

Научные статьи о медицине Казахстана

Международные отношения

Научные статьи посвященные международным отношениям

Педагогика

Научные статьи по педагогике, воспитанию, образованию

Политика

Научные статьи посвященные политике

Политология

Научные статьи по дисциплине Политология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Психология

В разделе "Психология" вы найдете публикации, статьи и доклады по научной и практической психологии, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. В своих работах авторы делают обзоры теорий различных психологических направлений и школ, описывают результаты исследований, приводят примеры методик и техник диагностики, а также дают свои рекомендации в различных вопросах психологии человека. Этот раздел подойдет для тех, кто интересуется последними исследованиями в области научной психологии. Здесь вы найдете материалы по психологии личности, психологии разивития, социальной и возрастной психологии и другим отраслям психологии.  

Религиоведение

Научные статьи по дисциплине Религиоведение опубликованные в Казахстанских научных журналах

Сельское хозяйство

Научные статьи по дисциплине Сельское хозяйство опубликованные в Казахстанских научных журналах

Социология

Научные статьи по дисциплине Социология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Технические науки

Научные статьи по техническим наукам опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физика

Научные статьи по дисциплине Физика опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физическая культура

Научные статьи по дисциплине Физическая культура опубликованные в Казахстанских научных журналах

Филология

Научные статьи по дисциплине Филология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Философия

Научные статьи по дисциплине Философия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Химия

Научные статьи по дисциплине Химия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Экология

Данный раздел посвящен экологии человека. Здесь вы найдете статьи и доклады об экологических проблемах в Казахстане, охране природы и защите окружающей среды, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. Авторы рассматривают такие вопросы экологии, как последствия испытаний на Чернобыльском и Семипалатинском полигонах, "зеленая экономика", экологическая безопасность продуктов питания, питьевая вода и природные ресурсы Казахстана. Раздел будет полезен тем, кто интересуется современным состоянием экологии Казахстана, а также последними разработками ученых в данном направлении науки.  

Экономика

Научные статьи по экономике, менеджменту, маркетингу, бухгалтерскому учету, аудиту, оценке недвижимости и пр.

Этнология

Научные статьи по Этнологии опубликованные в Казахстане

Юриспруденция

Раздел посвящен государству и праву, юридической науке, современным проблемам международного права, обзору действующих законов Республики Казахстан Здесь опубликованы статьи из научных журналов и сборников по следующим темам: международное право, государственное право, уголовное право, гражданское право, а также основные тенденции развития национальной правовой системы.