Показателями безопасности являются хорошая переносимость противогриппозного лекарственного препарата, а так же оставшиеся в пределах нормы морфологические показатели периферической крови и биохимические показатели сывороток у подопытных лабораторных животных.
Введение
В последние годы вирус гриппа, в особенности, вирус гриппа типа А приковывает к себе большой интерес со стороны мировой общественности. Это связано, прежде всего, с периодическими вспышками данной инфекции в различных частях планеты. Возбудителем очагов инфекции является вирус гриппа типа А, отличающийся от других типов, способностью поражать не только животных и птиц, а также и людей.
Возбудители гриппа типа А являются возбудителями гриппозных пандемий в ХХ столетии. Наиболее разрушительной из них оказалась пандемия «испанки» А/(H1N1), которая разразилась в 1918-1919 гг. унесла, по разным подсчетам, от 20 до 100 млн. жизней.
На сегодняшний день имеются различные способы борьбы с вирусными инфекциями, в том числе и с гриппом, такие как вакцинация и лечение лекарственными средствами.
В последнее время изготовление противовирусных препаратов постепенно переходит от синтеза химических соединений к использованию фармакологически активных веществ растений, что обусловлено меньшей их токсичностью, а также большим разнообразием химической структуры. Среди фармакологически активных растительных соединений интерес к флавоноидам, кумаринам, эфирным маслам и др. начинает усиливаться во всём мире.
Изучение растений широко применяемых в народной и традиционной медицине, а так же разработка на их основе высокоэффективных лекарственных средств является одной из актуальных задач медицинской и фармацевтической науки [1, 2]. Лекарственные препараты растительного происхождения обладают преимуществом перед синтетическими, которое заключается в малой токсичности, большей частью мягкостью действия, редким индуцированием аллергических реакций и возможностью проведения повторных и длительных курсов лечения и профилактики.
Основным источником для поиска новых лекарственных растений является арсенал средств народной медицины. С этой точки зрения особый интерес представляют растения семейства Lamiaceae, широко используемые в нетрадиционной медицине. Лечебным эффектом обладает эфирное масло, содержащееся в растениях данного семейства [2, 3], а именно эфирное масло Котовника украинского, на основе которого и был получен исследуемый противогриппозный лекарственный препарат.
Раннее были проведены работы по изучению безопасности, защитного действия и лечебно-профилактической эффективности, где и было установлено, что противогриппозный лекарственный препарат, в концентрации 40 мг/кг эфирного масла в дозе 25 мкл для мышей и 100 мкл для морских свинок безопасен, обладает как профилактическим так и лечебными свойствами против штамма A/ California /7/2009/(H1N1) pdm09 вируса гриппа на 60-80 % [4].
Для дальнейшего изучения безопасности, были проведены доклинические испытания исследуемого лекарственного препарата на лабораторных животных, а именно изучение острой токсичности, что является одним из основных и обязательных этапов при разработке и внедрении в медицинскую практику иммунобиологических препаратов [5, 6].
Материалы и методы
В работе использовали 3 экспериментальные серий противогриппозного лекарственного препарата против гриппа A/H1N1. Исследуемый препарат приготовлен из эфирного масла, выделенного из растения Котовника украинского (Nepeta ucranica) произрастающего на территории Республики Казахстан, который представляет собой жидкую форму в виде капель и по предназначению вводится в организм интраназально. Испытание проводилось на двух видах лабораторных животных обоего пола: белых мышах и морских свинках с живой массой 25-30 г. и 350-400 г., соответственно.
В исследованиях использованы клинически здоровые животные, содержащиеся в соответствии с действующими правилами [7].
Лабораторные животные распределялись по группам случайным образом методом рандомизации на 2 группы (опытная и контрольная). В качестве критериев приемлемости рандомизации считали отсутствие внешних признаков заболеваний и гомогенность групп по весу тела (± 20%). Для испытания 3 экспериментальных серий препарата, каждая группа состояла из 8 особей в опыте на мышах и 6 особей в опыте на морских свинках, включая контрольные группы. Каждому животному был присвоен индивидуальный номер (в соответствии с номером группы и порядковым номером).
Испытание острой токсичности противогриппозного лекарственного препарата на системы и органы лабораторных животных определяли введением опытным группам 0,1 мл то есть 4 дозы для мышей (1 стандартная доза в объеме 25 мкл, вводилась 4 раза в течение 4 часов с интервалом между введением – 1 час) и 0,2 мл лекарственного препарата морским свинкам, то есть 4 дозы (по 50 мкл), интраназально в концентрации 40 мг/кг эфирного масла. Для контрольных групп в качестве негативного контроля использовали раствор натрия хлорида.
Токсическое действие противогриппозного препарата оценивали по клиническим признакам интоксикации, показателям общего состояния, изменения поведения, наличия судорог, оценки координации движения, интенсивности и характера двигательной активности, ежедневной регистрации массы тела, потребление воды и пищи.
Для определения влияния препарата на организм, изучали гематологические, морфологические и биохимические показатели крови животных [8, 9, 10, 11], кровь у мышей получали пункцией хвостовой вены, а у морских свинок из сердца.
Статистическую обработку экспериментальных данных, определяли согласно среднему значению выборки и ее среднеквадратичной ошибки. Достоверность различий между показателями (р<0,05) определяли с применением критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
На протяжении всего периода клинического наблюдения общее состояние и поведение животных всех экспериментальных групп соответствовало обычному характеру живот- ных, общее состояние опытных и контрольных групп (потребление воды, корма и внешний вид) было удовлетворительным, признаков болезни и случаев гибели не отмечено, при этом достоверные отличия между опытной и контрольной группой отсутствовали.
Интенсивность и характер двигательной активности, координация движений, тонус скелетных мышц сохранялись на фоновом уровне. Поведенческие реакции не отклонялись от нормы опытных групп от группы контроля, состояние волосяного и кожного покрова, окраска слизистых были без патологических изменений.
В таблице 1 и 2 приведены результаты динамики массы тел через 24 ч, 7 и 14 сут после введения противогриппозного препарата опытным группами и контрольным.
Таблица – 1 Среднее значение изменения массы тела белых мышей (самок и самцов) при определении острой токсичности противогриппозного препарата
Таблица – 2 Среднее значение изменения массы тела морских свинок (самок и самцов) при определении острой токсичности противогриппозного препарата
Представленные в таблицах 1 и 2 данные показывают, что массы тела белых мышей и морских свинок в трех группах не имели значительных различий (р<0,05).
В нормальных физиологических условиях неизменно поддерживается постоянство морфологического и химического состава, а также и физико - химических свойств крови. Изменения состава крови, которые во многих случаях являются вторичными, обусловленными нарушениями физиологической деятельности различных систем или органов при воздействии различных лекарственных и иммунобиологических препаратов, могут отразиться на нормальном функционировании организма. Учитывая, что кровь в той или иной степени отражает, как в зеркале, многое из того, что происходит в организме. Для изучения безопасности экспериментальных серий противогриппозного препарата использовали лабораторно - инструментальные методы по показателям общего анализа крови (гемоглобин, гематокрит, эритроциты, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, лимфоциты, моноциты). Результаты гематологических исследований периферической крови при изучении острой токсичности противогриппозного лекарственного препарата представлены в таблицах 3 и 4.
Таблица – 3 Влияние противовирусного препарата на морфологический состав периферической крови белых мышей
Таблица – 4 Влияние противовирусного препарата на морфологический состав периферической крови морских свинок
Данные представленные в таблицах 3 и 4 свидетельствуют об отсутствии достоверных различий между уровнями гемоглобина, эритроцита, гематокрита и лейкоцитарной формуле в контрольных и опытных группах лабораторных мышей после введения экспериментальных серии противогриппозного препарата (р<0,05). Отсутствовали также достоверные различия между самками и самцами.
При изучении морфологического состава крови лабораторных мышей и морских свинок, после введения дозы препарата отмечено незначительное снижение гемоглобина и тромбоцитов по сравнению с контрольной группой.
Результаты, представленные в таблицах 3 и 4 , свидетельствуют, что обнаружено незначительное снижение эозинофилов, которое свидетельствует в пользу отсутствия аллергизирующего действия данного препарата на лабораторных мышей.
Таким образом, применение противогриппозного препарата у мышей и морских свинок не вызвало достоверных изменений в морфологическом составе периферической крови, уровне гемоглобина и гематокрита по сравнению с контрольной группой. Выявленные изменения могут быть интерпретированы с точки зрения активизации иммунного ответа.
Результаты биохимических исследований крови при изучении острой токсичности препарата.
Для адекватной оценки изменения физиологического состояния макроорганизма на фоне воздействия противогриппозного лекарственного препарата провели определение в сыворотке крови лабораторных мышей и морских свинок комплекса наиболее информативных показателей активности ключевых ферментов метаболизма, а также показателей белкового, углеводного и липидного обмена – общего белка, мочевины, креатинина, холестерина, глюкозы, билирубина общего и связанного, активности аспартамаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) (таблицы 5 и 6).
Таблица 5 – Влияние лекарственного препарата на основные биохимические показатели периферической крови белых мышей
Таблица 6 – Влияние лекарственного препарата на основные биохимические показатели периферической крови морских свинок
Биохимическое исследование крови подопытных животных не показывало увеличение содержания общего белка, как у мышей так и у морских свинок независимо от введенных дозы противовирусного препарата. При этом тенденция к гиперпротеинемии имела устойчивый характер, т.к. наблюдалась при исследовании всех трех серий лекарственного препарата. Следует также отметить, что наиболее выраженные изменения наблюдались у самок. Анализ литературных данных [12] свидетельствует, что полученные данные могут быть результатами профилактического процесса.
Соответственно, практически не повышался уровень мочевины и креатинина. Уровни глюкозы, холестерина, общего и связанного билирубина, трансаминаз у животных опытной группы не отличались от результатов контрольной группы (р<0,05). Таким образом, введение противогриппозного лекарственного препарата не вызывает существенных изменений основных биохимических показателей крови лабораторных мышей и морских свинок.
В результате наблюдения за общим состоянием и поведением животных всех экспериментальных установлено отсутствие отклонений от нормы, это является доказательством хорошей переносимости препарата на лабораторных животных.
Отсутствие снижения веса в течение наблюдения всего опыта свидетельствует об отсутствии специфического воздействия исследованного препарата на аппетит и потребление воды. Прирост массы тела как в контрольной, так и в опытных группах животных показывает отсутствие различий в усвояемости пищи.
Выводы
В ходе проведенных исследований токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 7 и 14 дней после острого введения противогриппозного лекарственного препарата в превышающей дозе в 4 раза, не влияет на внешний вид, общее состояние, массу тела и поведение животных, а так же не оказывает негативного влияния на биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма. Полученные нами результаты позволяют отнести противогриппозный лекарственный препарат к V классу – практически нетоксичных лекарственных веществ. Состояние животных после острого введения препарата свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата.
Литература
- Горяев М.И. Эфирные масла флоры СССР. Алма-Ата: Изд. АН Каз ССР, 380 с.
- Буйко Р.А. Гращенков А.Е., Маковкина А.О., Соколов В.С. Библиография по эфирномасличным растениям и эфирным маслам (указатели отечественной литературы за 1747 – 1965 гг.). Л.: Наука, 1968. 275 с.
- Смолянова А.М. Эфирномасличные культуры / М.: Колос, 1976. 331 с.
- Отчет о научно-исследовательской работе «Разработка противовирусных препаратов как средств неспецифической защиты от потенциально пандемических вирусов гриппа A/Н1N1» НТП «Мониторинг, изучение, разработка средств диагностики, профилактики и терапии гриппа «инфлюэнца A/H1N1» исполн.: Касенов М.М., Гвардейский, 2011 Инв №0211РК01630, № госрегистрации 0111РК00433
- «Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP)», (РД 64-126-91. М., 1992);
- Кукес В.Г., Булаев В.М., Колхир В.К., и др. Методические указания по доклиническому изучению новых препаратов, разрабатываемых из природного сырья. В сб. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармацевтических веществ М., Минздрав РФ – С. 346-348.
- Каркищенко Н.Н., Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях М., 2010. – С. 123-151.
- Сидорова К.А., Калашникова М.В., Пашаян С.А. Клиническая гематология животных (учебное пособие) // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2014. – № 3 – С. 131-131.
- Любина А.Я., Ильичева Л.П., Катасонова С.А., Петросова С.А., Клинические лабораторные исследования «Медицина» 1984. – С. 63-69.
- Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии (справочник в 2-х томах) /Под ред. А.И. Карпищенко. − СПб.:Интер-медика, 1999. − Т. 2. 350 с.51
- МсCleskey E. Fluorometric method for the determination of urea in blood / J. E. McCleskey // Anal. Chem. — 1964. — Vol. 36. — P. 1646-1648.
- Козинца Г.И. Атлас клеток крови и костного мозга «Триада - Х»