Другие статьи

Цель нашей работы - изучение аминокислотного и минерального состава травы чертополоха поникшего
2010

Слово «этика» произошло от греческого «ethos», что в переводе означает обычай, нрав. Нравы и обычаи наших предков и составляли их нравственность, общепринятые нормы поведения.
2010

Артериальная гипертензия (АГ) является важнейшей медико-социальной проблемой. У 30% взрослого населения развитых стран мира определяется повышенный уровень артериального давления (АД) и у 12-15 % - наблюдается стойкая артериальная гипертензия
2010

Целью нашего исследования явилось определение эффективности применения препарата «Гинолакт» для лечения ВД у беременных.
2010

Целью нашего исследования явилось изучение эффективности и безопасности препарата лазолван 30мг у амбулаторных больных с ХОБЛ.
2010

Деформирующий остеоартроз (ДОА) в настоящее время является наиболее распространенным дегенеративно-дистрофическим заболеванием суставов, которым страдают не менее 20% населения земного шара.
2010

Целью работы явилась оценка анальгетической эффективности препарата Кетанов (кеторолак трометамин), у хирургических больных в послеоперационном периоде и возможности уменьшения использования наркотических анальгетиков.
2010

Для более объективного подтверждения мембранно-стабилизирующего влияния карбамезапина и ламиктала нами оценивались перекисная и механическая стойкости эритроцитов у больных эпилепсией
2010

Нами было проведено клинико-нейропсихологическое обследование 250 больных с ХИСФ (работающих в фосфорном производстве Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции)
2010


C использованием разработанных алгоритмов и моделей был произведен анализ ситуации в системе здравоохранения биогеохимической провинции. Рассчитаны интегрированные показатели здоровья
2010

Специфические особенности Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции связаны с производством фосфорных минеральных удобрений.
2010

Применение полимеразной цепной реакции для выявления точечной мутации у быков-производителей

Авторами статьи проведена работа по генотипированию племенных быков-производителей АО «Асыл-Тулик» и ТОО «Асыл» на наличие генетических мутации с помощью полимеразной цепной реакции в сочетании с ПДРФ анализом. По результатам исследования быки-производители являются свободными от вредных генетических мутации -  BLAD, CVM, DUMPS и Citrullinemia. 

Введение

В настоящее время описаны множество наследственных заболеваний крупного рогатого скота различных видов и пород. Быстрота и точность диагностики многих из них значительно повысились благодаря достижениям молекулярной биологии, развитию молекулярно-генетических методов регистрации полиморфных локусов ДНК и мутационных изменений, созданию эффективных ДНК-диагностических процедур для исследования человека и различных видов сельскохозяйственных животных. Анализируя мировую литературу по генетике крупного рогатого скота, следует отметить, что в последние годы получено много новых данных по генетическим дефектам у этого вида животных. Так, если сравнивать количество летальных дефектов крупного рогатого скота в списке Визнера и Виллера 1979, и Millar, 2000, то в первом из них их число равно 46, а во втором 403 [1,2].

Определение носителей мутаций играет важную роль в работе племенных хозяйств. Продажи племенных бычков невозможны без тестирования на летальные мутации. Тестирование коров и телок также необходимо для снижения затрат на осеменение и выращивание молодняка. Все наследственные заболевания крупного рогатого скота в той или иной степени связаны с нарушением репродуктивной функции у коров, снижением резистентности организма телят, у носителей мутации генетического дефекта часто регистрируются эмбриональная смертность, повышение индекса осеменения в результате ранней смертности предимплантационных эмбрионов в период беременности. Так, наследственное заболевание крупного рогатого скота, дефицит лейкоцитарной адгезии BLAD (bovineleukocyteadhesiondeficiency) сопровождается снижением иммунитета  у телят, предрасположенностью у молодняка к бактериальным инфекциям. По данным различных авторов данный генетический дефект наносит большой экономический ущерб животноводству [3].

Комплексное уродство позвоночника у крупного рогатого скота, CVM (complexvertebralmalformation) как летальная аутосомальная рецессивная наследственная болезнь  впервые была описана  в 2001 году американским ученым Agerholm J .S. [4].

DUMPS (Deficiencyofuridinemonophosphatesynthase), является смертельным наследственным аутосомно-рецессивным расстройством крупного рогатого скота, которое сопровождается эмбриональной смертностью в период имплантации в начальной    стадии стельности у коров. В клетках млекопитающих, на последней стадии, синтез пиримидиновых нуклеотидов включает конверсию оротата в уридинмонофосфатсинтетазу (UMP) и этот биохимический процесс катализируется ферментом UMP  синтетаза. Фермент UMP-синтетаза является необходимым для синтеза пиримидиновых нуклеотидов, которые входят в состав ДНК и РНК. Рост и развитие гомозиготных рецессивных предимплантационных эмбрионов заканчиваются эмбриональной смертностью, приблизительно на  40-й день после зачатия [5].

Citrullinemia - это врожденное нарушение обмена веществ из-за дефицита фермента цикла мочевины, аргининсукцинатсинтетазы (L-citrulline:L-aspartateligase). Эта болезнь была впервые описана у людей, но относительно недавно установлена у молочного скота Австралии. Обычно больные гомозиготные по гену сitrullinemia телята рождаются нормальными, но на второй и третий день они становятся вялыми, отмечаются признаки депрессии и снижается аппетит. Такие животные погибают на 7-й день после рождения с клиническими признаками коллапс, слепота и резкое ухудшение состояния больного животного. Анализ последовательности гена ASAS показал, что  нуклеотидная замена C на T является причиной точечной мутации у крупного рогатого скота. Известно, что у животных носителей мутации Citrullinemia исчезает сайт рестрикции для эндонуклеазыAva II и этот полиморфизм  используется для ПЦР диагностики [3,4,5].

В настоящее время, интенсивный обмен генетическими материалами между странами требует проведения систематического мониторинга качества биоматериалов, таких, как замороженная сперма, замороженный эмбрион и живой скот. Во всех странах с развитым животноводством большое внимание уделяется своевременной диагностике генетических дефектов у племенных животных с целью недопущения распространения гетерозиготных носителей.

В связи свышеизложенным, целью настоящей работы было проведение мониторинга племенных быков-производителей на носительство генетических мутаций BLAD, CVM, DUMPS и Citrullinemia.

Материал и методика исследований

Исследования проводились на 68 племенных быках-производителей АО «Асыл- Тулик» Акмолинской области и на 43 быках ТОО «Асыл» Алматинской области в рамках реализации проекта «Мониторинг племенных животных Республики Казахстан на носительство генетических дефектов с помощью молекулярно-генетических методов» на период 2012-2013 годы в учебно-научно-диагностической лаборатории Казахстанско- Японского инновационного центра Казахского национального аграрного университета. Породный состав исследуемой группы быков-производителей АО «Асыл-Тулик» представлен более 14 породами отечественной и зарубежной селекции, а в ТОО «Асыл» были, в основном быки, местной Алатауской породы и быки мясной породы зарубежной селекции. Анализ документов племенных животных зарубежной селекции показывает, что 38% быков-производителей были протестированы на наличие генетического дефекта методом полимеразной цепной реакции и результаты тестирования были обозначены BL, бык свободен от гена BLAD синдрома и   TV, бык свободен от гена CVM.

В качестве материала для исследования были использованы замороженные образцы спермы быков-производителей в соломинках АО «Асыл-Тулик» и пробы спермы, замороженные в виде гранул быков ТОО «Асыл». Объем замороженной  спермы в пайеттах 0,2 мл и гранул 0,5 мл. Существуют разные способы выделения ДНК из биологических материалов. На сегодня самым распространенным и простым в методическом плане остается метод выделения ДНК с помощью фенол-хлороформ- изоамилового  спирта,  который  позволяет  выделить  из  спермы  качественную  ДНК    в большом количестве и с высокой концентрацией. Однако этот метод представляет определенную опасность для здоровья исследователя и поэтому нами был использован наряду с фенол-хлороформ-изоамиловый спирт методом, метод выделения ДНК с помощью набора «ДНК сорб В».

При выделении ДНК из замороженной спермы быков-производителей по методу Bahnak центрифугировали 0,2 мл спермы в течение 5 минут при 4000 g. Осевшие клетки промывали 0,15 М раствором NaCI, 2мМ ЭДТА и центрифугировали в течение 5 минут при 4000 g. Эту процедуру повторяли дважды. Затем, после последнего центрифугирования верхний слой отсасывали с помощью пипетки, а к осадку добавляли лизирующий буфер Bahnak в количестве 1 мл, имеющий следующий состав: 6М гуанидинтиоцианат, 25 мМ цитрат натрия рН 7,0, 0,5% Sarcosyl, 0,1 М 2-меркаптоэтанол и инкубировали при 370С в течение 30 минут. Перед депротеинизациейлизированный раствор ДНК разбавляли 0,15 М раствором NaCL в соотношении 1:4. Депротеинизацию осуществляли по обычной методике, путем добавления равного объема смеси фенол- хлороформ-изоамиловый спирт (24:24:1). После центрифугирования осторожно отсасывали верхний слой пипеткой и осаждали в двух объемах 96% этилового спирта. Высушивали ДНК в течение 2-5 минут под вытяжным шкафом и растворяли в буфере ТЕ [6].

При выделении ДНК из замороженной спермы быков-производителей с помощью набора «ДНК сорб В», с целью оптимизации и выделения более качественной ДНК из спермы быков-производителей нами был использован способ предварительной обработки спермы следующим образом: вносили в пробирку 200 мкл спермы, затем добавляли 1 мл лизирующего буфера, имеющий состав 100 мМТрис, 20 мМ ЭДТА, 10 мМNaCI, рН 8,0 и перемешивали в течение 30 секунд, далее центрифугировали g10000 об/мин в течение 5 минут. После центрифугирования, суспендировали осадок в 500 мкл буфера:  100 мМТрис, 20 мМ ЭДТА, 10 мМNaCI, рН 8,0 и добавляли 8 мкл 2-меркаптоэтанола. Затем перемешивали на вортексе в течение 1 минуты и оставляли на 30 минут при комнатной температуре. Подготовленную таким способом смесь  в  количестве  100  мкл использовали для выделения ДНК с помощью набора «ДНК сорб-В»  согласно инструкции.

В первую очередь, перед выделением ДНК прогревали лизирующий раствор и раствор для отмывки №1 из набора «ДНК-сорб-В» в течение 1 часа при температуре 65 °С. Затем, внесли в пробирку 100 мкл подготовленную с меркаптоэтанолом смесь и тщательно перемешивали на вортексе и прогревали 5 минут при температуре 65 °С. Центрфугировали 5 секунд при 5000 об/мин на микроцентрифуге. В каждую пробирку, затем вносили 25 мкл универсального ресуспендированного сорбента из набора. Перемешивали на вортексе, ставили на штатив на 2 минуты, затем повторяли эту процендуру еще раз и ставили на штатив на 5 минут. Осаждали сорбент центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 секунд. Удаляли надосадочную жидкость, затем вносили по 300 мкл раствора для отмывки №1. Перемешивали на вортексе, осаждали сорбент центрфугированием, удаляли надосадочную жидкость. Вносили 500 мкл раствора для отмывки №2, перемешивали на вортексе, центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость. Повторяли процедуру отмывки с использованием раствора для отмывки №2. Подсушивали сорбент универсальный после удаления надосадочной жидкости в термостате при 65 °С в течение 5-10 минут. В пробирки вносили по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешивали на вортексе, инкубировали в термостате при 65 °С в течение 5 минут с периодическим встряхиванием. Центрифугировали пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги в течение 1 минуты.  Надосадочная  жидкость  содержит  очищенную  ДНК,  которую  в   последущем использовали для полимеразной цепной реакции. Качество и количество выделенной таким способом ДНК проверяли на 0,8 % агарозном геле.

Проведение полимеразной цепной реакции для детекции точечной мутации у быков- производителей. Тестирование животных на наличие генетических дефектов, в первую очередь, включает выбор праймеров для амплификации нужного фрагмента ДНК. Нами была проведена работа по подбору соответствующих пар праймеров для проведения эксперимента. Сначала с сайта NCBI вывели из базы данных полную последовательность генов BLAD, CVM, DUMPS и Citrullinemia. Для ПЦР диагностики BLAD и CVM использовали последовательности праймеров других авторов, а для выявления мутации DUMPS, Citrullinemia кроме праймеров известных авторов, был произведен дизайн собственных праймеров с помощью программы Primer 3. При разработке праймеров мы учитывали размер амплифицируемого фрагмента, для хорошей визуализации при агарозном электрофорезе и размеры фрагментов после рестрикции соответствующей эндонуклеазой,  оптимальной длины для определения носителей мутации.

Полимеразную цепную реакцию проводили на термоциклере «Терцик» производства России, который имеет четыре блока по 10 ячеек в каждом блоке. Для выявления полиморфизма гена CD 18 мы использовали следущиепраймеры: прямой праймер 5′- AGGCAGTTGCGTTCAATGTGA - 3′ и обратный праймер 5′- CCGACTCGGTGA TGCCATTGA - 3′. Специфические праймеры были синтезированы лабораторией AppliedBiosystems. Использование данной пары праймеров позволяет амплифицировать 159 пар нуклеотидов фрагмента гена CD 18.

Условия проведения полимеразной цепной реакции: первый шаг - денатурация ДНК при температуре 94 °С – 5 минут, второй шаг – денатурация при 94 °С – 45 сек, отжиг праймеров – 62 °С 45 сек и элонгация при температуре 72 °С 45 сек. Завершающий синтез при 72 °С с продолжительностью 2 мин. Хранение при +4 °С. Объем реакционной смеси был 50 мкл, имеющий следующий состав: 5 мкл 10 Х буфера для ПЦР, 1,5 мМ MgCl2, 2,5 мкл 25 мкМ прямого и обратного праймеров, 5 мкл 0,2 мМ концентрации каждого dNTP, 0,5 мкл фермента TaqPolymerase с активностью 5u/μl, 5 мкл ДНК и 26,5 мкл дистиллированной воды.

   

Рисунок 1. Электрофореграммаамплификата гена CD 18, длина амплификата 159 п.н.

Готовили обычно реакционную смесь на 10 реакций и внесли в каждую пробирку готовую ПЦР реакционную смесь в количестве 18,5 мкл и добавляли в каждый образец по 5 мкл ДНК и нанесли по 2 капли минерального масла. Для проведения полимеразной цепной реакции использовали тонкостенную пробирку Эппедорфа объемом 0,5 мл.

Продолжительность амплификации составила 35-40 циклов, после окончания амплификации готовили 3% агарозу и заливали гель. В каждую лунку агарозного геля внесли по 7 мкламплификата, а в первую лунку в качестве ДНК маркера, pUC19DNA рестрицированная рестриктазойMspI. Данный маркер имеет, фрагменты длиной 501,489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34, 34 пар нуклеотидов. Продукт амплификации подвергали электрофорезу при режиме: напряжение 180 В, сила тока 150 мА, мощность 50 Вт и продолжительность 45-60 минут. В случае успешной амплификации, на электрофореграмме хорошо виден бэнд размером 159 п.н. (рисунок 1). Визуализацию результатов амплификации и продукта рестрикции осуществляли с помощью гель- документирующей системы. Результаты электрофореза документировали в виде электронного варианта и распечатали электрофореграммы. У здоровых животных появляется сайт рестрикции для рестриктазыTaq I и амплификат после рестрикции дает два фрагмента размером 110 и 49 пар нуклеотидов (рисунок 2).

 Электрофореграмма продуктов рестрикции амплификата гена CD 18 эндонуклеазой Taq I, длина фрагментов  49 и 110 п.н.

ДНК, выделенная из замороженной спермы быков былаамплифицирована для ПЦР диагностики DUMPS и Citrullinemia в течение 40-45 циклов. Продукт амплификации проверяли в 3%-ной агарозе. Для выявления носителей мутации DUMPS ставили рестрикцию амплификата с рестриктазойAva I, а для детекции носителей CitrullinemiaрестриктазойAva II. После рестрикции ставили горизонтальный электрофорез в 3%-ной агарозе и результаты электрофореза зафиксировали с помощью гель-документирующей системы. В таблице 1 показаны основные параметры амплификатов и продуктов рестрикции при генотипировании быков-производителей на - BLAD, CVM, DUMPS и Citrullinemia.

Результаты исследований и их обсуждение

В результате проведенных экспериментов в течение 2012-2013 гг было протестировано всего быков-производителей АО «Асыл-Тулик» 68 голов и ТОО   «Асыл»

43 головы на наличие генетических мутаций BLAD и CVM, 54 головы быков- производителей АО «Асыл-Тулик» на генетические дефекты DUMPS, Citrullinemia.

Важным   этапом    настоящей    работы  была      оптимизация   условий   проведения полимеразной цепной реакции и способов выделения ДНК из спермы. Экпериментальным путем были установлены оптимальный состав ПЦР буфера и необходимая концентрация MgCl2 для ПЦР диагностики BLAD. Успешно амплификация прошла при концентрации 1,5 мМ MgCl2, оптимальным был состав буфера 100 мМTris-HCI (рН 8,8), 500 мМ KCI. При   повышении   концентрации   MgCl2     до   3-4   мМ   отмечается   неспецифическая амплификация, а при снижении концентрации MgCl2 наблюдается очень низкий сигнал. При       проведении             ПДРФ-ПЦР            анализа           большое     значение           имеет           качество используемой ДНК. Опыт работы показывает, что выход пригодной для амплификации ДНК обеспечивает выделение ДНК по методу Bahnak, где предусмотрено использование фенол-хлороформ-изоамилового спирта. Применение способа выделения ДНК с помощью набора  «ДНК  сорб  В»  позволяет  генотипировать  племенных  животных  методом  ПЦР анализа, однако выход ДНК относительно низкий и составляет 60-70 %.

По результатам исследования 68 животных АО «Асыл-Тулик» и 43 головы ТОО «Асыл» имеют нормальный генотип по исследуемым локусам, BLAD и CVM. Отсутствие носителей генетических дефектов у племенных быков-производителей можно объяснить тем, что основная часть исследуемых животных, были местной Алатауской, Аулиекольской, Казахской белоголовой, Аулиеатинской пород, которые в своей родословной не имеют предков, носителей мутации. Быков-производителей зарубежной селекции проверены всего 52 головы, из них 27 животные были тестированы на наличие генетических дефектов BLAD и CVM. В настоящее время методом полимеразной реакции было проверено 54 головы на наличие точечной мутации DUMPS, Citrullinemia и результаты были отрицательные.

Выводы

Результаты исследований позволяют утверждать, что для мониторинга племенных животных наиболее доступным и точным способом является – метод  полимеразной цепной реакции в сочетании с ПДРФ анализом. Установлено, что племенные быки- производители АО «Асыл-Тулик» и ТОО «Асыл» являются свободными от вредных генетических мутаций,  BLAD, CVM, DUMPS и Citrullinemia.

 

Литература 

  1. Яковлев А.Ф., Прохоренко П.Н. Cовременные тенденции использования генетики в животноводстве // Вестник РАСХН. № 2. С. 56–59.
  2. Марзанов Н.С., Ескин Г.В., Турбина И.С., Девришев Д.А., Тохов М.Х., Марзанова С.Н. Генодиагностика и распространение аллеля иммунодефицита, или BLAD синдрома, у черно-пестрой породы крупного рогатого скота. Москва
  3. Meydan H, Mehmet Y, Agerholm J Screening for bovine leukocyte adhesion deficiency, deficiency of uridine monophosphate synthase, complex vertebral malformation, bovine citrullinaemia, and factor XI deficiency in Holstein cows reared in Turkey ActaVeterinariaScandinavica 2010, 52:56
  4. Agerholm JS: Inherited disorders in Danish cattle. APMIS 2007, 122 (Suppl).
  5. Schwenger B, Tammen I, Aurich C: Detection of homozygous recessive genotype for deficiency of uridine monophosphate synthase by DNA typing among bovine embryos produced in vitro. J ReprodFertil 1994, 100:511-514.
  6. Bahnak B.R. A single and efficient vethod for isjlating high molecular weight DNA from mammalian sperm.// NAR. -1988
  7. Grupe S, Diet G, Schwerin M: Population survey of citrullinemia on German livestockProdSci 1996, 45:35-38.

Разделы знаний

Архитектура

Научные статьи по Архитектуре

Биология

Научные статьи по биологии 

Военное дело

Научные статьи по военному делу

Востоковедение

Научные статьи по востоковедению

География

Научные статьи по географии

Журналистика

Научные статьи по журналистике

Инженерное дело

Научные статьи по инженерному делу

Информатика

Научные статьи по информатике

История

Научные статьи по истории, историографии, источниковедению, международным отношениям и пр.

Культурология

Научные статьи по культурологии

Литература

Литература. Литературоведение. Анализ произведений русской, казахской и зарубежной литературы. В данном разделе вы можете найти анализ рассказов Мухтара Ауэзова, описание творческой деятельности Уильяма Шекспира, анализ взглядов исследователей детского фольклора.  

Математика

Научные статьи о математике

Медицина

Научные статьи о медицине Казахстана

Международные отношения

Научные статьи посвященные международным отношениям

Педагогика

Научные статьи по педагогике, воспитанию, образованию

Политика

Научные статьи посвященные политике

Политология

Научные статьи по дисциплине Политология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Психология

В разделе "Психология" вы найдете публикации, статьи и доклады по научной и практической психологии, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. В своих работах авторы делают обзоры теорий различных психологических направлений и школ, описывают результаты исследований, приводят примеры методик и техник диагностики, а также дают свои рекомендации в различных вопросах психологии человека. Этот раздел подойдет для тех, кто интересуется последними исследованиями в области научной психологии. Здесь вы найдете материалы по психологии личности, психологии разивития, социальной и возрастной психологии и другим отраслям психологии.  

Религиоведение

Научные статьи по дисциплине Религиоведение опубликованные в Казахстанских научных журналах

Сельское хозяйство

Научные статьи по дисциплине Сельское хозяйство опубликованные в Казахстанских научных журналах

Социология

Научные статьи по дисциплине Социология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Технические науки

Научные статьи по техническим наукам опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физика

Научные статьи по дисциплине Физика опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физическая культура

Научные статьи по дисциплине Физическая культура опубликованные в Казахстанских научных журналах

Филология

Научные статьи по дисциплине Филология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Философия

Научные статьи по дисциплине Философия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Химия

Научные статьи по дисциплине Химия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Экология

Данный раздел посвящен экологии человека. Здесь вы найдете статьи и доклады об экологических проблемах в Казахстане, охране природы и защите окружающей среды, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. Авторы рассматривают такие вопросы экологии, как последствия испытаний на Чернобыльском и Семипалатинском полигонах, "зеленая экономика", экологическая безопасность продуктов питания, питьевая вода и природные ресурсы Казахстана. Раздел будет полезен тем, кто интересуется современным состоянием экологии Казахстана, а также последними разработками ученых в данном направлении науки.  

Экономика

Научные статьи по экономике, менеджменту, маркетингу, бухгалтерскому учету, аудиту, оценке недвижимости и пр.

Этнология

Научные статьи по Этнологии опубликованные в Казахстане

Юриспруденция

Раздел посвящен государству и праву, юридической науке, современным проблемам международного права, обзору действующих законов Республики Казахстан Здесь опубликованы статьи из научных журналов и сборников по следующим темам: международное право, государственное право, уголовное право, гражданское право, а также основные тенденции развития национальной правовой системы.