Введение в культуру IN VITRO и микроклональноеразмножение перспективных сортов, клоновых подвоев и дикорастущих форм яблони

Для получения растений Malus in vitro наиболее эффективным является способ стимулирования роста побегов из покоящихся почек в лабораторных условиях. В результате был получен высокий процент стерильных эксплантов с использованием меньшей продолжительности обработки в стерилизующих агентах (0,1% раствор HgCl2 в течение 7 минут) На этапе введения в культуру in vitro оптимальна жидкая питательная среда МС, содержащая 30 г/л сахарозы с добавлением 0,5 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП), 0,01 мг/л индолилмасляной кислоты (ИМК), 1 мг/л гибберелловой кислоты и 1 мг/л аскорбиновой кислоты, рН 5,7. Для дальнейшего размножения асептических побегов яблони эффективна твердая среда МС с добавлением 0,5 мг/л БАП, 0,01 мг/л ИМК, 4 г/л агар, 1,75 г/л джелрайт, рН 5,7.

Введение

Биотехнологические методы микроклонального размножения тканей и органов растений на искусственных питательных средах получили широкое распространение [1-4]. Клонирование ценных сортов, подвоев, уникальных форм из минимального количества исходного материала по сравнению с традиционным (вегетативным) методом размножения имеет ряд преимуществ: возможность получать саженцы круглый год независимо от сезона; сокращение селекционного процесса за счет отбора форм по нужным признакам непосредственно в культуре in vitro; высокий коэффициент размножения. Использование асептических оздоровленных растений in vitro в международном обмене гермоплазмой облегчает процедуру прохождения карантинного контроля, так как современные стандарты на посадочный материал требуют оздоровления его от вирусной и микоплазменной инфекции [2,4, 5-8].

Микроклональное размножение включает несколько этапов. В первую очередь – это отбор первичного экспланта, его стерилизация, подбор оптимальных условий культивирования для роста и развития побегов на питательной среде [1, 5-6]. Трудность введения древесных культур, особенно яблони, в асептические условия, связана  с высоким процентом инфицированности растительного материала при отборе его в полевых условиях, а также значительным содержанием фенольных соединений в тканях, приводящих к некрозу изолированных эксплантов. Инфицированность растительного материала связана с высокой зараженностью его бактериальной, микоплазменной, а также вирусной инфекцией.

В плодовых насаждениях юга и юго-востока республики выявлено 7 вирусных заболеваний на яблоне, из которых наиболее вредоносные – хлоротическая пятнистость листьев яблони, вирус (ямчатости древесины) растрескивания стволаи вирус бороздчатости   древесины[6,   9,   10].   Среди   грибных   заболеванийяблони      наиболее распространенными являются: парша, мучнистая роса, ржавчина, черный рак.Из бактериальных чаще всего встречаются: рак корня, черная пятнистость, бактериальный ожог и другие, чаще всего эти заболевания носят инфекционный характер, для их предотвращения проводят корчевание и сжигание на месте поражённых деревьев[11-13].

В связи с этим на данный момент остро встал вопрос о закладки маточных садов чистосортным материалом, размноженным в учреждениях, занимающихся производствомоздоровленного посадочного материала класса супер-суперэлита, где вегетативное потомство получают в культуре in vitro от единичного исходного растения, отобранного по сортовой (клоновой) типичности с гарантированной чистотой от всех известных вирусных,бактериальных и микоплазменных заболеваний, свободное от карантинных объектов [14].

Ранее мы описывалиусовершенствованный способ введения в культуру invitroнекоторых сортов и форм яблони [4]. В данной работе мы продолжили оптимизировать способы введения в культуру in vitro для клоновых подвоев и для вновь исследуемых сортов и дикорастущих форм.

Целью настоящей работы являлось создать коллекцию invitroперспективных сортов, клоновых подвоев яблони Казахстанской и зарубежной селекции, а так же дикорастущих форм, отработать эффективные режимы стерилизации при введении в культуру in vitro, оптимизировать питательные среды на этапах введения и размножения асептических растений.

Материалы и методы

Объектами исследования служили перспективные сорта яблони(Malusdomestica Borkh.)казахстанской и зарубежной селекции из коллекции Помологического сада Каз- НИИ плодоводства и виноградарства (ИПВ): Апорт Александр, Восход, Голден Делишес, Егемен, Заря Алатау, Максат, Рашида, Рояль Ред Делишес, Салтанат, Синап Алматинский, Талгарскоеи из коллекции Иле-Алатауского национального парка (ИАНП) АпортАлександр. Клоновые подвои: Арм 18, Жетысу 5, Б16-20, Б7-35, М9, ММ106,62-396 (из коллекции ИПВ) и дикорастущие формы Malussieversii(Ledeb. M. Roem.) КГ, КГ1, КГ4, КГ6, КГ7, КГ8, КГ9, КГ13 (ИАНП) и ТМ6 (ИПВ) [11].

Первый способ введения в культуру in vitro. Черенки длиной 20-30 см срезали в феврале-мартеу однолетних побегов, промывали в мыльном растворе и проточной воде, затем в течение 5 мин обрабатывали разбавленным раствором отбеливателя «Белизна» (1:1) и промывали в проточной воде. Для стимуляции побегообразования из покоящихся почек черенки помещали в сосуды с раствором, содержащим ½ концентрацию минеральных солей Мурасиге и Скуга (МС) [15], с добавлением 1 мг/л гибберелловой кислоты (ГК)и 1 мг/л аскорбиновой кислоты (АК), рН 5,6. Через 2-4 недели отросшие побеги длиной 1-2 см срезали и в ламинарном боксе стерилизовали в 0,1% растворе сулемы (HgCl2) в течение 5 и 7 мин, или в 0,1% растворе HgCl2 в течение 3 мин, а затем в растворе отбеливателя «Белизна» (1:1) в течение 2 мин с последующим промыванием в стерильной воде.

Второй способ введения в культуру in vitro. Отросшие в полевых условиях побеги срезали с деревьев на опытном участке с конца апреля по июнь. Апексы побегов длиной 2-3 см обрабатывали мыльным раствором и промывали в проточной воде. Далее в ламинаре верхушки побегов поверхностно стерилизовали в 0,1% растворе HgCl2 в течение 5, 7 и 10 мин.

Далее, как при I, так и при II способе введения, асептические верхушки побегов помещали на мостики из фильтровальной бумаги в пробирки с жидкой средой МС, содержащей 30 г/л сахарозы с добавлением регуляторов роста:0,5 мг/л 6- бензиламинопурина (БАП), 0,01 мг/л индолилмасляной кислоты (ИМК), 1 мг/л ГК и 1 мг/л АК,рН 5,7. Ежедневно побеги переносили на свежую среду. Через 2-4недели выжившие микропобеги пересаживали на твердую среду МС с добавлением 0,5 мг/л БАП, 0,01 мг/л ИМК, 1,75 г/л джелрата. 4 г/л агара, рН 5,7.

Введённые в культуру in vitro экспланты были протестированы на отсутствие эндофитной инфекции. Для этого срезанные основания микрочеренков (3-5 мм) помещали в чашки Петри с питательной средой Vissс 10 г/л сахарозы, 8 г/л гидролизата казеина, 4 г/л дрожжевого экстракта, 2 г/л KH2PO4, 0,15 г/л MgSO4·7H2O и 6 г/л джелрайта[16] и выдерживали при температуре 25°С в течение 1 недели.

В экспериментах использовали 10-20 апексов побегов. Опыт проводили в 2-3 повторностях (n = 20-60).Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по общепринятым методикам, описанным в пособии Г.Ф. Лакина[17].

Результаты и их обсуждение

На первоначальном этапе работы был использованрежим стерилизацииапексов побегов в 0,1% растворе сулемы в течение 5 минут с последующей обработкой разбавленным 1:1 раствором «Белизны» в течение 2 минут после чего был отмечен некроз и гибель всех эксплантов сортов Салтанат, Синап Алматинский, Рашида и Заря Алатау, по-видимому, раствор «Белизны» губителен для нежных слабо-опушенных побегов яблони, отросших в лабораторных условиях.После 7 минутной экспозиции в HgCl2 процент регенерации побеговбыл выше (55,0%), по сравнению с 5 минутной обработкой (30,7%) (рисунок 1).

В статье Трушечкина с соавторами говорится об использовании в качестве исходных эксплантов при введении в культуру in vitro меристематических верхушек размером до 1 мм, что дало положительные результаты для сеянцев яблони и отрицательные для  сортов и клоновых подвоев. Авторы рекомендуют для сортов и клоновых подвоев использовать верхушки побегов размером 1-2 см [18]. В наших экспериментах при первом способе введения,размеры вводимых в культуру in vitro побегов не превышали 2 см, однакопри втором способе в поле срезали черенки 5-6 см, а во время стерилизации в ламинарном боксе при обновлении среза, побеги вводились размером 2-3 см.

Рисунок 1 – Результаты введения в культуру invitro апексов побегов яблони с использованием первого способа(проращивание побегов из зимующих почек в лабораторных условиях)

Примечание – значения, обозначенные одинаковыми буквами, достоверно не различаются между собой при р ≤ 0,05 Для введения в культуру invitro II способом использовали 5, 7 и 10 минутную стерилизацию эксплантов в 0,1% растворе HgCl2. После 5 минутной экспозиции установлено 64,3% инфицированности эксплантов и 35,7% погибли в результате некроза (рисунок 2). Не выявлено статистически достоверных отличий жизнеспособности растений после экспозиции 7 и 10 минут в растворе сулемы, однако процент жизнеспособности после 10 минутной обработки (18,4%) был несколько выше по сравнению с 7 минутной обработкой (10,9%).

Рисунок 2 – Результаты введения в культуру in vitro апексов побегов яблони вторым способом (использование побегов, проросших в полевых условиях)

Примечание – значения, обозначенные одинаковыми буквами, достоверно не различаются между собой при р ≤ 0,05 Сравнение двух способов введения в культуру in vitro показало, что количество выживших микропобегов было значительно выше при I способе введения: до 55% эксплантов успешно развивались на питательной среде, тогда как при II  способе выживало максимально 18,5% микрочеренков. Это связано с высокой инфицированностью побегов при II способе введения – 56,0%, по сравнению с 21,5% инфицированности при I способе, что и повлияло в целом на эффективность I способа введения в условия in vitro.

При первом способе введения, когда побеги проращивают в лабораторных условиях, длительность обработки стерилизующим раствором (0,1% HgCl2) может быть снижена  до

7 мин. Тогда как при втором способе введения, с использованием молодых побегов, проросших в полевых условиях, продолжительность стерилизации должна быть не менее 10 минут.

При введении яблони в культуру in vitro необходимым приемом для снижения влияния токсичных фенольных соединений, выделяемых микропобегамив среду, является ежедневное пассирование эксплантов на свежую среду в течение первых 2-4 недель до прекращения видимого специфического окрашивания среды. Экспериментально было также установлено, что большое значение для выживанияизолированных эксплантов яблони имеет структура питательной среды. Более эффективной на этапе введения яблони в культуру in vitro является жидкая среда. Возможно, это связано с лучшей диффузией и более равномерным распределением выделяемых фенольных соединений в жидкой  среде.

Кроме того, для побегов небольшого размера 1-2 см в пробирки необходимо помещать фильтровальные мостики, чтобы предотвратить полное погружение их в жидкую среду.

Одним из наиболее актуальных моментов при введении побегов в условия in vitro и их дальнейшего успешного микроклонального размножения является контроль чистоты пробирочных растений. Бактериальную инфекцию не всегда легко обнаружить, т.к. она часто локализована во внутренних тканях, при этом растения не имеют видимых симптомов заражения, могут несколько месяцев культивироваться на питательных средах, но через какое-то время инфекция проявляется, и весь растительный материал становится непригодным. Для проверки чистоты растительных тканей использовали специализированную питательную среду для роста бактерий Viss [16, 19]. В качестве затвердевающего компонента в ней используется джелрайт, который в отличие от агара придает среде прозрачность. Основания побегов помещали в чашки Петри на среду Viss, и наблюдали в течение недели. Чашки состерильнымиэксплантами остаются прозрачными, тогда как помутнение среды и рост колоний указывают на инфицированность микропобегов, которые следует сразу же отбраковывать.

Большое значение при введении в культуру invitro имеет состав питательной среды. Так, добавление в среду МС для размножения ГК стимулировало вытягивание побегов, что важно только на первых этапах введения в культуру invitro. Это свойство ГК отмечено и другими авторами [2, 6]. Но дальнейшее добавление ГК в питательную среду для размножения приводит к чрезмерному истончению побегов яблони.

Введение аскорбиновой кислоты в питательную среду уменьшало количество фенольных веществ, выделяемых эксплантами яблони. Поэтому аскорбиновая кислота в питательной среде также необходима только на начальных этапах введения в культуру invitro. Оптимальной для введения в культуру invitro являлась жидкая питательная среда следующего состава: МС содержащей 30 г/л сахарозы с добавлением 0,5 мг/л БАП, 0,01 мг/л ИМК, 1 мг/л ГК и 1 мг/л АК, рН 5,7, на которой наблюдали  хорошее развитие побегов (рисунок 4, А).Для дальнейшего микроклонального размножения использовали твердую питательную среду МС содержащей 30 г/л сахарозы с добавлением 0,5 мг/л БАП, 0,01 мг/л ИМК, 4 г/л агар и 1,75 г/л джелрайт, рН 5,7 (рисунок 4Б). В качестве затвердевающего компонента, кроме агара,в питательную среду также добавляли джелрайт, что увеличивало прозрачность среды и облегчало контроль за стерильностью культур invitro.

Рисунок 4 – Развитие побегов яблони invitro

Выводы

Таким образом, в результате проведенных исследований по введению яблони в культуру in vitro было показано, что наибольший процент выживших побегов и наименьший процент инфицированности был при первом способе введения, когда экспланты получали, стимулируя рост побегов из покоящихся вегетативных почек в лабораторных условиях. При этом требовалась меньшая длительность обработки стерилизующими агентами для достижения высокой степени стерильности эксплантов. Установлено, что наиболее эффективным режимом стерилизации микропобегов яблони при этом способе введения является выдерживание эксплантов в 0,1% растворе сулемы в течение 7 минут.

Наиболее благоприятной для введения в культуру in vitro является жидкая питательная среда МС,содержащая 30 г/л сахарозы,с добавлением 0,5 мг/л БАП, 0,01 мг/л ИМК, 1 мг/л ГК и 1 мг/л АК и, рН 5,7. Для дальнейшего размножениямикрочеренков яблони оптимальной является твердая среда МС с добавлением 0,5мг/л БАП, 0,01 мг/л ИМК, 4 г/л агара, 1,75 г/л джелрайта, рН 5,7.

В дальнейшем, полученные асептические растения, будут использованы  для создания криобанка растений яблони Казахстана в жидком азоте, и могут быть вовлечены в селекционный процесспо улучшению существующих и созданию новых сортов, а также для международного обмена растительными ресурсами

Работа выполнена в рамках проекта 0491/ГФ3 «Создание криогенного банка перспективных сортов и клоновых подвоев яблони на основе методов биотехнологии» по бюджетной программе: 055 «Научная и/или научно-техническая деятельность», подпрограмма 101 «Грантовое финансирование научных исследований».

Литература 

1. Трускинов Э.В. Культура in vitro как современный способ воспроизведения, сохранения и интродукции вегетативно размножаемых растений // Биолог.разнообразие. Интродукциярастений. – С.П., 2007. – С.
2. Brischia R., Piccioni E., Standardi A. Micropropagation and synthetic seed in M.26 apple rootstock (II): A new protocol for production of encapsulated differentiating propagules // Plant Cell. TissueandOrganCultures. – 2002. – V. 68, – N 2. – P. 137-141.
3. Ковальчук И.Ю., Волгина М.А., Насибулина А.Х. Использование клональногомикроразмножения в селекции плодовых и ягодных культур // Ускорение размножения посадочного материала плодовоягодных культур с использованием биотехнологических методов. – Алма-Ата: КАСХН. – 1991. – С. 6-14.
4. Ромаданова Н.В., Кушнаренко С.В. Микроклональное размножение некоторых сортов яблони: введение в культуру in vitro // Поиск. Серия естественных и технических наук.– № 1.– 2006.– С. 54-58.
5. Матушкина О.В. Оптимизация процессов регенерации при размножении клоновых подвоев и сортов яблони и груши: автореф. дис. на соиск. уч. степ.канд. с.-х наук:06.01.07. – Мичуринск. 2008 г. 22 с.
6. Долгих С.Г., Карычев К.Г., Остаркова Л.В. Клональноемикроразмножение и оздоровление сортов и подвоев яблони // Научные достижения в биотехнологии, виноградарстве и ягодоводстве – Алматы, НИЦ «Бастау». – 1997.– С. 3-7.
7. Pence V.C., Engelmann F., Guarino L., RamanathaRao V., Goldberg E.Collecting in vitro for genetic resources conservation //In: Collecting Plant Genetic Diversity: Technical Guidelines. Bioversity International. – Rome. – 2011.– 5
8. Engelmann F.,AltmanА., Hasegawa M.H. Germplasm collection, storage, and conservation // Plant Biotechnology and Agriculture. Oxford: AcademicPress. – 2011. – 255-268.
9. Бриндаров Д.Д. Диагностика вирусных болезней яблони: автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата с.-х наук: 06.01.11. – Москва. – 2005 г. – 20 с.
10. Омашева М.Е., Качиева З.С., Копытина Д.А., Касенова А.М., Аубакирова К.П., Ережепов Д.А., Галиакпаров Н.Н., Рябушкина Н.А. Разработка диагностической тест системы на основе мультиплекс ОТ-ПЦРтрех вирусов яблони ACLSV, ASGV, ASPV //«Поиск» серия естественных и технических наук. – №2 (1). – 2012. – С. 27-34.
11. СальниковЕ.М. Перспективные сорта яблони для Юга и Юго-Востока Казахстана// Пособие для фермеров и садоводов-любителей. – Алматы, 2010. – 80 с. Сальников, Е. М.
12. Сальников Е.М., Петров С. Е. Селекционная оценка гибридного материала яблони на устойчивость к парше // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана. – 2008. –№ 10. – С. 16-18.
13. Нурмуратулы Т., Карычев Р.К., Култаев А.К. В помощь фермерам-плодоводам. – Алматы, 2011. – 96 с.
14. Избасаров Д.С., Калтаев С.К., Маденов Э.Д., Нурмуратулы Т.Н., Карычев К.Г., Янкова А.И., Уразаева М.В., Нуртазина Н.Ю.,Сальников Е.М., Береснева Л.В. Рекомендации о порядке производства посадочного материала плодовых культур и винограда в Алматинской области. – Алматы, 2010. – 30 с.
15. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol Plant. – 1962. – V. 15. – P. 473-479.
16. Viss R., Brooks E.M., Driver J.A. A simplified method for the control of bacterial contamination in woody plant tissue culture // In Vitro Cell. Dev. Biol. – 1991. – V. 27. – C. 42.
17. Лакин Г.Ф. Биометрия // М.: Высшая школа, 4 изд, – 1990. – 213 с.
18. Трушечкин В.Г. Высоцкий А.В., Леонтьев-Орлов О.А. Размножение клоновых подвоев яблони методом культуры ткани // Сельскохозяйственная биология. – 1982. – Т. XVII, – № 4. – С. 455-457.
19. Reed B.M., Tanprasert P. Detection and control of bacterial contaminants of plant tissue cultures. A review of recent literature // Plant Tissue Culture and Biotechnology. – 1995. – V. 1, N. 3. – P. 137-142.