Получение гаплоидных регенерантов рапса путем культуры микроспор

Введение

Важным направление в современной селекции является создание улучшенных и принципиально новых генотипов сельскохозяйственных растений, обладающих единичной, групповой или комплексной устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессовым факторам среды при сохранении и повышении их продуктивности и качества. В Казахстане потребности в растительном масле для внутреннего потребления стабильно растут. Так, в Послании Президента Республики Казахстан от 8 февраля 2008г говорится, что необходимо особое внимание уделить стимулированию производства важнейших продуктов питания, по которым не удовлетворяются потребности страны, в частности растительного масла. По оценке председателя Совета ассоциации таможенных брокеров РК Геннадия Шестакова, сегодня в Казахстан завозится до 50% растительного масла.

Дефицит растительных жиров на рынке Казахстана составляет 60 тыс. т.

Широкому внедрению рапса в Казахстане препятствует отсутствие сортов, адаптированных к местным почвенно-климатическим условиям [1, 2].

Существенным дополнением, повышающим эффективность традиционных методов селекции рапса, является гаплоидная технология [15]. Результаты исследований ряда авторов показали, что до сих пор эмбриогенез в культуре пыльников in vitro различных видов Brassica происходит спонтанно и имеет низкую частоту выхода гаплоидных растений (1-4%), более того предлагаемые технологии трудно воспроизводимы и недостаточно изучены на каждом этапе андрогенеза. В настоящей работе с помощью метода культуры микроспор проанализирован способ получения  гаплоидных регенерантов рапса, с целью оптимизировать регламент получения дигаплоидов рапса (B. napus L.) в культуре микроспор.

Методы

Растения ярового рапса выращивались в теплице ИББР. Посев обычный рядовой. Глубина посева семян 2-3 см. Фенологические наблюдения проводились ежедневно. Отмечались даты наступления основных периодов вегетации – всходы, стеблевание, бутонизация, цветение, появление стручков, созревание. Проводилось описание элементов морфологии – высота растений, площадь и окраска листовых пластинок, число и размер бутонов и цветков.

Введение в культуру проводилось в зимне-весенний – с доноров, выращенных в теплице. Закладка опытов, фенологические наблюдения, уход за посевами, гибридизация проводились согласно общепринятым методикам [13].

Изоляцию микроспор и посадку их на питательные среды проводили в асептических условиях – и ламинарных боксах, которые стерилизуют ультрафиолетовыми лучами в течение 15-20 минут.

При выполнении работы соблюдали условия стерилизации питательных сред, посуды, расходного (вата, вода, бумага), посадочного материала (соцветия, бутоны), инструментов (пинцеты, иглы и т.д.).

В исследовании использовали жидкую среду, которая разработана для получения гаплоидов из культуры микроспор растений: NLN, MS и Гамборга (В5) (табл.1).

Донорные растения перед введением в культуру in vitro должны содержать достаточное количество физиологически активных веществ. С этой целью, при выращивании донорных растений в теплице, готовили смесь почвы и песка в соотношении 3:1, добавляли удобрения из расчёта N:P=3:1 кг/га[3,6].

Влажность почвы поддерживали на уровне 70 - 80% от полной влагоёмкости. Интенсивность освещения составляла 20-25 тыс. люкс, фотопериод 16 часов день, 8 часов ночь, температура 15-26°С в дневное и 10-15°С в ночное время суток.

Сбор бутонов и соцветий проводили рано утром в часы интенсивного деления пыльцы, их размер находился в интервале 1,5-4,5 миллиметров (мм), и по 40-60 штук (шт.). Обрабатывали соцветия в течение 2 суток при температуре +4-6°С с последующим культивированием изолированных пыльников in vitro при температуре +32°С в течение 2 суток [14].

Изоляция микроспор проводилась по методу Кастерса (2002г.) и Эфтода С. [15] с нашими модификациями. Для эффективной изоляции микроспоры от зародыша использовали микросмеситель Vitek 1472PR. Зародыши помещали в прохладный микросмеситель (10ºC), используя 5-10 мл прохладной среды B5 (10-12ºC), и гомогенизировали 5-7 сек.

Таблица 1 – Прописи состава питательных сред мг/л

 Прописи состава питательных сред мг/л

Результаты

Модифицирована методика Кастерса (2002г.) и Эфтода С.[16] культивирования изолированных микроспор.

 

Исследования проводили на бутонах из соцветий, которые изолировали как с главного, так и боковых побегов. Схема включала 3 варианта:

  • обработка соцветий низкой положительной температурой (+4+6°С) в течение 2 суток до введения и после введения микроспор при температуре +25°С в течение двух суток в культуру in vitro;
  • обработка бутонов при температуре +10;+15°С до введения и после введения в культуру in vitro высокой температурой (+32°С) в течение 2 суток;
  • сочетание низкой положительной температуры (+4+6°С) в течение 2 суток (до введения в культуру in vitro) с последующей обработкой высокой температурой (+32°С) в течение 2 суток после введения микроспор в культуру in vitro.

Оптимальной была обработка соцветий в сочетании низкой положительной температуры (+4+6°С) в течение 2 суток (до введения в культуру in vitro) с последующей обработкой высокой температурой (+32°С) в течение 2 суток после введения пыльников в культуру in vitro.

В результате проведенных анализов был выявлен оптимальный состав минеральных солей из прописи среды NLN. В этих условиях микроспоры сохраняли свою жизнеспособность на протяжении длительного периода выращивания в условиях in vitro, и нами был отмечен процесс прямого эмбриогенеза [8, 16] (рис1).

  Развитие микроспор : a) формирование эмбриоидов, б) формирование проростка на 19 день наблюдений

Рисунок 1 – Развитие микроспор : a) формирование эмбриоидов, б) формирование проростка на 19 день наблюдений 

Было установлено, что быстрое развитие эмбриоидов в проростки происходило на агаризованной питательной среде, содержащей гормоны, в то время как в жидких условиях культивирования (на мостиках) сначала развивалась корневая система, а затем гипокотильная часть проростка. При длительном культивировании растений в условиях жидкой среды наблюдали спонтанное образование вторичных эмбриоидов, которые формировались из эпидермальных клеточных слоев гипокотиля и семядолей [5,9,10].

Повышенная температура культивирования в течение 14 суток положительно влияет на выход эмбриоидов на всех изучаемых средах, за исключением среды Мурасиге-Скуга (MS). Микроспоры, культивируемые в стандартных температурных условиях, индуцировали эмбриоиды с частотой 0,6%, при культивировании в опытных условиях - 0,4%. Максимальная частота выхода эмбриоидов – 1,6% получена на среде NLN при повышенной температуре. Резкое различие в выходе эмбриоидов наблюдали на среде В5,

Повышенная температура стимулирует образование эмбриоидов с 1,3%. Низкий выход эмбриоидов (0,3%) наблюдали при культивировании микроспор на среде MS в стандартных температурных условиях + 26°С.

Обсуждение результатов

Культивирование  микроспор  в  условиях  с  повышенной  температурой  -  32°С,   в течение 14 суток стимулирует эмбриоидогенез в микроспорах ярового рапса. Результаты исследований показали, что эти модификации увеличивают выход гаплоидных регенерантов.

Заключение

  1. Модифицирована методика Кастерса (2002г.) и Эфтода [16] культивирования изолированных микроспор.
  2. Оптимизирована среда для культивирования культуры изолированных микроспор, больший выход гаплоидов дала среда NLN.
  3. Подобраны оптимальные параметры удвоения хромосомного набора гаплоидных регенерантов.

 

 

Литература

  1. А.С.Скакун, И.В. Бурда, Д. Брауэр. РАПС – культура масличная. – Минск,1994.
  2. Хозяйственно-биологическая характеристика сортов сельскохозяйственных культур. Минск 1998.
  3. А.Н.Анохин. Справочник агронома. – Изд. «Урожай»
  4. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. – М.: Наука,
  5. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений – М Наука,
  6. Шевелуха B.C. Рост растений и его регуляция в онтогенезе. – М.: Колос,
  7. Шевелуха В.С., Калашникова С.В., Дегтярев С.В. Сельскохозяйственная биотехнология – М.: Высшая школа,
  8. Муравлев А.А. Культура пыльников в селекции ярового рапса. // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. –2007.
  9. Май Дык Чунг, Калашникова Е.А. Экспериментальный морфогенез в культуре изолированных пыльников растений различных видов Brassica // Материалы Международной конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биотехнологии», 2008. Брянск,
  10. Ницше В. Гаплоиды в селекции растений. /В. Ницше, Г. Веицель/ М.: Колос.-1980.- 128 с.
  11. Паушева 3. Н. Практикум по цитологии растений. /3. Н. Паушева// М.: Агропромиздат. - 1988. - 271 с.
  12. Плотников В. А. Факторы лимитируюшие морфогенез в культуре пыльников подсолнечника. / В. А. Плотников // Культура клеток растений. – Абовян. – 1979. – с. 155.
  13. Пустовойт В. Т. Руководство по селекции и семеноводству масличных культур. /под руководством В. Т. Пустовойта / М.: Колос, 1967. – 351с.
  14. Раджи А. С. Влияние обработки донорных растений парааминобензойной кислотой на выход каллуса и регенерантов в культуре пыльников яровой пшеницы. / А. С. Раджи, Г. Н. Иванова, В. В. Ефремова // Труды Кубанского гос. агр. унив. – 1991. – – С. 62-66.
  15. Соколов В. А. Технология гаплоидов в генетике и селекции растений. / В. А. Соколов, Шумный В. К. // Вавиловское наследие в современной биологии / М.: Наука. – С.247-270.
  16. Eftoda Microspore Culture in Brassica species. eftoda@yahoo.com March. -2002.
Фамилия автора: Затыбеков А.К., Волков Д.В.
Год: 2011
Город: Алматы
Яндекс.Метрика