Получение компонентов нутталийного диагностикума

Разработана технология получения нутталийного гамма-глобулина как одного из компонентов диагностикума для постановки серологических реакций на нутталиоз лошадей. Отработаны оптимальные условия иммунизации лабораторных животных нутталийным антигеном, очистки и концентрации нутталийного гамма-глобулина.

Введение

Нутталиоз лошадей – трансмиссивное сертифицируемое при ввозе и вывозе лошадей остро, подостро, реже хронически протекающее заболевание, характеризующееся явлениями перемежающейся лихорадки, угнетением, анемией,  желтушностью (лимонного, шафранного цвета), истощением, нарушением сердечно-сосудистой, дыхательной и пищеварительной систем, вызываемое специфическими облигатными внутри эритроцитарными простейшими паразитами отряда Piroplasmida (), семейства Theileriidae (Du Toit, 1918), рода Nuttallia (Franca, 1909) [1].

Впервые  наблюдали  паразитов  в  крови  лошади  Guglielmi  в  1899  г.  в  Италии  и Rickmann  в  1900  г.  в  Юго-Западной  Африке.  Нутталиоз  лошадей  и  его    возбудителя подробно описали в 1901 г. L.Laveran и A.Theiler. Название паразиту - Nuttallia equi присвоили лишь в 1910 г. ученые Nuttall и Strickland, подтвердив название, данное паразиту ученым Franca в 1909 г. В России нутталиоз впервые описал Н.А.Михин в 1908 г., а затем он же и В.Л.Якимов в 1909 г., но они считали эту болезнь пироплазмозом [2].

Заболевание лошадей нутталиозом зарегистрировано во многих странах Африки, Европы, Азии, Центральной и Южной Америки. В 1976 г. нутталиоз впервые установлен в Австралии. На территории Союза нутталиоз имел широкое распространение в южных и восточных зонах страны и ряде регионов РСФСР [2].

Нутталиоз лошадей наносит значительный экономический ущерб в виде снижения массы тела, уменьшения приплода и его слабой жизнеспособности, ослабления половой активности и снижения качества спермы, сдерживания продуктивности, препятствии в улучшении породных качеств животных, смертности.

Диагностика нутталиоза проводится на основании учета эпизоотологического состояния местности, наличия специфических биологических переносчиков – иксодовых клещей рода Dermacentor, сезона года, клинических признаков и результатов микроскопического и серологического исследования. Решающим моментом в постановке положительного диагноза являются результаты исследования мазков крови. Нутталии выделяются при окрашивании мазков периферической крови краской Гимза по Романовскому в виде так называемого «мальтийского креста» или в виде четырех точек, в основном, по периферии эритроцита [1,2]. Однако, своеобразная, малая форма возбудителя в виде нескольких точек при нутталионосительстве, наличие в крови здоровых животных некоторых включений (тельца Жолли и др.), трудно отличимых от нутталий, зачастую затрудняют диагностику нутталиоза и, особенно, нутталионо- сительства, которое длится после клинического выздоровления до 15-18 лет и которое служит постоянным источником для заражения кровососущих клещей и распространения заболевания среди здоровых, особенно племенных лошадей. Методы биопробы и спленэктомии подозреваемых в нутталионосительстве животных, как это рекомендовано для жвачных животных, в данном случае не всегда осуществимы из-за громоздкости и дороговизны.

Все перечисленные трудности обнаружения нутталий и их дифференциации от пироплазм, артефактов, различных включений крови, особенно, в начале болезни и при паразитоносительстве, вызвали необходимость изыскивать и совершенствовать специфические и более эффективные средства диагностики.

Вопрос применения серологических диагностических тестов при  кровепаразитозах, в том числе при нутталиозе издавна интересовал исследователей, так как этим методом помимо клинически выраженной болезни можно безошибочно выявить скрытое паразитоносительство. Кроме диагностической значимости иммунологические реакции необходимы для изучения и расшифровки сущности иммунных процессов в организме больных и переболевших животных, раскрытие которых ускорит решение проблемы специфической профилактики.

Серологические методы диагностики при кровепаразитозах (анаплазмозе) впервые применили Сплиттер с сотр. [3]. В СНГ работы по внедрению серологической диагностики при различных кровепаразитозах, по отработке методики приготовления антигена из паразитов проводили Н.И.Степанова, Х.Георгиу, Т.Т.Сулейменов, Г.С.Шабдарбаева [4, 5, 6, 7, 8].

В Казахстане для серологической диагностики нутталиоза лошадей антиген из инвазированной паразитами крови был разработан и апробирован К.Т.Раисовой [9].

Анализ литературных данных показывает, что в настоящее время иммунологические исследования   при   инвазионных   заболеваниях   животных,   в   т.ч.   при       нутталиозе, направлены на обнаружение циркулирующих антител в сыворотке крови [10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17].

Однако, по мнению ряда авторов [10,14] анализы этого типа недостаточно объективны и, более того, сам принцип обнаружения  антител характеризуется невысокими предсказательными возможностями, т.к. в начальной стадии инвазии или при ее протекании в легкой форме уровень антител может быть ниже предела чувствительности обнаружения, что порождает ложноотрицательные ответы. И, наоборот, в некоторых случаях специфические антитела могут сохраняться в кровотоке на заметном уровне даже спустя длительное время после выздоровления, из-за чего при проведении иммуноанализа могут быть получены ложноположительные ответы. Кроме  того, в отличие от методов обнаружения антигенов количественное определение антител невозможно, поскольку на результаты иммуноанализа могут влиять и афинность антител [12, 17].

Многие иммунологические тесты в качестве необходимого компонента требуют использования антисывороток к паразитарным антигенам, либо выделенных из них гамма- глобулиновых фракций. Однако, у естественно инвазированных животных титр антител, как правило, невысок и они малопригодны в качестве стандартных реагентов.

С учетом вышеизложенного, нами была разработана технология получения нутталийной сыворотки и нутталийного гамма-глобулина, который был выделен из гипериммунных сывороток крови кроликов к нативному нутталийному антигену и использован при постановке иммуноферментного анализа в качестве стандартного реагента для прижизненной диагностики нутталиоза лошадей.

Материалы и методы

На первом этапе исследований подбирали с учетом реактивности  организма опытных животных – лошадей двухлеток и ослов. Заражали их кровью, содержащей нутталии от опытных животных-доноров с трилоном-Б. Регулярными микроскопическими исследованиями периферической крови зараженных животных следили за нарастанием паразитемии. Для усиления паразитемии у некоторых животных использовали спленэктомию, т.е оперативное удаление селезенки – иммунокомпетентного органа. На высоте паразитемии, равной примерно 60–80 % из крови экспериментально зараженных нутталиозом ослов готовили корпускулярные нутталийные антигены по методу Н.И.Степановой (1970) в модификации К.Т.Раисовой. Корпускулярные антигены переводили в растворимое состояние путем дезинтеграции на аппарате УЗДН-3 (экспозиция – 10 мин.) и далее использовали для иммунизации кроликов с целью наработки паразитспецифичных антисывороток. Нами вначале были испытаны три метода иммунизации лабораторных животных корпускулярным нутталийным антигеном, предложенных H.Fey et all.(1976), А.М.Сафроновым (1976) и Г.Фримелем (1987). Далее в процессе работы для получения более высоких титров антител на модели нутталиоза, а также на других паразитологических моделях нами была применена модифицикация метода иммунизации, сущность которой заключалась в комбинированном использовании методов H.Fey et all. (1976) и Г.Фримеля (1987), на что получены охранные документы РК за №№14076; 17196; 17203; 17204; 17722; 22021; 22022; 22023; 22154.

Результаты исследований

Разработанная нами схема технологического процесса получения сухой гамма- глобулиновой фракции к нутталийному антигену выглядит следующим образом:

Первая стадия. Получение корпускулярного нутталийного антигена из крови лошадей и ослов, экспериментальным путем зараженных нутталиями и спленэктомированных с целью усиления паразитемии.

Вторая стадия. Получение гипериммунных сывороток крови к нутталийному антигену путем иммунизации лабораторных животных нутталийным антигеном. 

Третья стадия. Выделение гамма-глобулиновой фракции из гипериммунной сыворотки крови путем высаливания, ее концентрация.

Четвертая стадия. Составление серии нутталийного гамма-глобулина, расфасовка и этикетирование ампул.

Пятая стадия. Упаковка, маркировка и хранение гамма-глобулина.

Гипериммунные сыворотки крови получали иммунизацией кроликов (массой не менее 2,5кг) нутталийным антигеном по модифицированной нами методике. Иммунизацию кроликов проводили антигеном в дозе 1,5 мг в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) в соотношении 1:1 в подушечки четырех лапок по 0,25 см3 в каждую. Через 21 день кроликов реиммунизировали той же дозой антигена с ПАФ в бедренные мышцы обеих лапок по 0,5 см3 смеси в каждую.

Начиная с 7-го дня после второй иммунизации вели ежедневный контроль за титром преципитирующих антител реакцией количественной преципитации (РКП) или иммуноферментным анализом (ИФА). При достижении титра преципитирующих антител не ниже 1 мг/мл в РКП или 1:25000 в ИФА от кроликов брали кровь из краевой ушной вены спирт-ксилольным методом по 40 мл трехкратно, с интервалом в 72 ч.

При низких титрах антител (менее 1 мг/мл в РКП и ниже 1:25000 в ИФА) проводили дополнительную иммунизацию. Через 15 дней после реиммунизации проводили цикл внутривенных инъекций. Антиген в дозе 1,5 мг на кролика вводили двукратно с интервалом в 24 ч в центральную ушную вену. Во избежании аллергической реакции за 2 ч. до внутривенного введения кроликов сенсибилизировали малыми дозами антигена (25 мкг). Контроль за титром антител осуществляли в РКП или в ИФА. Собирали сыворотки отдельно от каждого иммунизированного кролика.

Затем из гипериммунной сыворотки крови путем высаливания сульфатом аммония (50 %) выделяли гамма-глобулиновую фракцию по общепринятой методике. Выделенный гамма-глобулин растворяли в минимальном количестве дистиллированной воды и обессоливали на колонке с сефадексом G-50 или диализом против проточной воды (12 ч.), дистиллированной воды (24 ч) и физиологического раствора (24 ч).

После обессоливания гамма-глобулин концентрировали в диализных трубках на полиэтиленгликоле (ПЭГ) –600 до содержания белка 10 мг/мл.

Каждую серию гамма-глобулина одновременно расфасовывали в ампулы по 2 см3 с содержанием белка 10 мг/ см3. Подвергали лиофильной сушке и запаивали под вакуумом. Ампулы этикетировали с указанием: наименования препарата, количества доз, даты изготовления, срока годности, номера серии.

Нутталийный гамма-глобулин представляет собой лиофилизированную гамма- глобулиновую фракцию, выделенную из гипериммунной сыворотки крови кроликов к нутталийному антигену и предназначен для использования при постановке иммуноферментного анализа для прижизненной диагностики нутталиоза однокопытных. Хранится в темном сухом помещении при температуре 2-10 С до 18 месяцев.

Полученный нутталийный гамма-глобулин испытывали в антиген выявляющем варианте ИФА с сыворотками крови спонтанно и экспериментально зараженных нутталиозом животных по методу A.Voller (1976), коньюгацию кроличьего JgG с пероксидазой и хрена Олайнского производства с показателем чистоты 2,7-3,2 производили по методу P.K.Nagane et all (1974).

Готовили карбонатно-солевой буферный раствор (рН 9,6) (КСБ) следующим образом: 0,1 М растворы натрия углекислого и натрия двууглекислого  на физиологическом растворе, затем к натрию углекислому приливали  натрий двууглекислый до рН 9,6.

Приготовление  фосфатно-солевого  буферного  раствора  (рН  7,2-7,4)  содержащего 0,05  %  твин  –80  (ФСБ-Т)  проводили  следующим  образом:  0,01  М  раствора     натрия фосфорнокислого однозамещенного приливали к двузамещенному натрию фосфорнокислому до рН 7,2-7,4. К фосфатно-солевому буферному раствору добавляли твин –80 из расчета 0,5 см3 на 1000 см3 буфера (0,05 %).

Субстратно-индикаторную смесь готовили следующим образом: 70 мг 5- аминосалициловой кислоты растворяли в 100 см3 дистиллированной воды при 70 оС, доводили рН до 6,0 0,1 М КОН и добавляли 0,16 см3 3%-ного раствора перекиси водорода.

Исследуемые сыворотки крови разводили КСБ 1:25.

Содержимое ампул с нутталийным гамма-глобулином растворяли 1:5000 в ФСБ-Т.

Разведение антител диагностических против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой (конъюгат) готовили согласно наставления по применению.

В лунки полистироловых иммунологических планшет вносили по 0,2 см3 раствора исследуемых сывороток крови, закрывали крышкой и инкубировали 18 ч при 4 0С или 3 ч при 37 0С. Затем планшеты промывали ФСБ-Т трижды и в лунки вносили раствор гамма- глобулина до 0,2 см3. Инкубировали 1 ч при 37 0С и промывали ФСБ-Т трижды, после чего в лунки вносили раствор антивидового кроличьего конъюгата по 0,2 см3. Инкубировали 1 ч при 37 0С и четыре-пять раз отмывали ФСБ-Т. Затем в лунки планшет вносили по 0,2 см3 субстратно-индикаторной смеси.

Останавливали реакцию через 20-40 мин добавлением в каждую лунку 0,05 см3 серной кислоты, приготовленной путем растворения 2 см3 концентрированной серной кислоты в 10 см3 дистиллированной воды.

Учет результатов реакции проводили визуально.

При наличии специфических нутталийных антигенов субстрат окрашивается в темно-коричневой дает. Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраски или имеющие слабое пожелтение.

Приготовленный нами гамма-глобулин к нутталийному антигену испытывался на чувствительность с заведомо позитивными нутталийными и заведомо отрицательными сыворотками в антигенвыявляющем варианте ИФА.

Результаты изучения чувствительности антиген выявляющего варианта ИФА при нутталиозе лошадей, где в качестве стандартного реагента использован приготовленный нами нутталийный гамма-глобулин приведены в таблице 1. 

Таблица-1. Чувствительность антиген выявляющего варианта ИФА при нутталиозе с применением нутталийного гамма-глобулина.

 Чувствительность антиген выявляющего варианта ИФА при нутталиозе с применением нутталийного гамма-глобулина.

Из таблицы 1 видно, что наивысший титр регистрировался при разведениях позитивной сыворотки в соотношении 1:640. Реакция была положительной в случае исследования позитивных нутталийных сывороток и отрицательной при исследовании негативной сыворотки здоровых животных, что показывает на объективность теста и возможности использования нутталийного гамма-глобулина в ИФА для прижизненной диагностики нутталиоза однокопытных.

Обсуждение результатов

Таким образом, в результате проведенных исследований приготовлены вначале нутталийная   сыворотка,   затем   нутталийный   гамма-глобулин,   пригодный   в качестве стандартного реагента при постановке серологических реакций (ИФА) для прижизненной диагностики нутталиоза и для использования в качестве идиотипа при наработке антиидиотипических антител.

Противопоказаний к применению нутталийного гамма-глобулина не выявлено.

Выводы При конструировании диагностикума для серологической диагностики нутталиоза важным компонентом является гамма-глобулин, выделенный из гипериммунных сывороток, полученных в результате иммунизации лабораторных животных нативным нутталийным антигеном.

 

 Литература

  1. Крылов М.В.    Пироплазмиды    (фауна,    систематика,    эволюция)//Л.,    «Наука»,Ленинградское отделение, 1981. С. 61; 109-110.
  2. Петровский В.В., Абрамов И.В. Нутталиоз лошадей//В кн. Протозойные болезни сельскохозяйственных животных. Под редакцией Н.И.Степановой. -М., «Колос», С.73-79.
  3. Splitter E.J., Twiehus M.J., Castro E.R. Anaplasmosis in sheep in the United states (Manhatten Kansas), // J. Am. Vet. Med. Ass. – 1955. – Vol. 127. - № –P. 244-245.
  4. Степанова Н.И. Иммунитет и серологическая диагностика анаплазмозов и тейлериозов рогатого скота: Автореф. дисс. докт. вет. наук. - М., 1971.49 с.
  5. Георгиу Х.      Экспериментальный         анаплазмоз      овец      (симптомокомплекс, иммунологические реакции): Автореф. дисс. канд. вет. наук. – М., 1980. 25 с.
  6. Георгиу Х. Сравнительная оценка серологических тестов (РДСК, РНГА и ИФА) для диагностики анаплазмоза рогатого скота и нутталиоза лошадей: Автореферат дисс. докт. биол. наук. - М., 1997. 50 с.
  7. Сулейменов Т.Т. Некоторые иммунобиологическое особенности A. ovis и совершенствование серодиагностики анаплазмоза. Дисс. канд. биол. наук. – Алма- Ата, 1986. 130 с.
  8. Шабдарбаева Г.С. Гемопаразитоценоз овец и иммунобиологические свойства антиидиотипических антител и диагностикумов при спонтанном и экспериментальном анаплазмозе овец. Дисс.канд.биол.наук. -Алма-Ата, 1990. 139 с.
  9. Раисова К.Т. Нутталиоз лошадей (эпизоотология, диагностика): Автореф. дисс. канд. биол. наук. -Алма-Ата, 1989. 20 с.
  10. Gingrich R.E. Aguired resisteance to Hypoderma lineatum. Comparative immunorestonse of resistent suspeptible cattle // Vet. Parasitol. -1982. -9-3-4. –P. 233-242.
  11. Carlier , Wery M. Methodes actualles de diagnosti immunologugue en parasitologie // Ann. Biol. Clin. – 1983. – 41. -6. – p. 435-444.
  12. Butler J.E., Feidbush T.L., Me Givern P.L., Stewardw. The enzimelinred immunosorbent assay (ELISA): a measure of antibody concentrion of affinity. // – 1978. - № 15. – р. 131-135.
  13. Carlier Y., Yang J., Bout., Capron A. The use of excretory-secretory antigen for of ELISA specific serodiagnos of visceral larva migrans // Biomedicine. – 1982. – 36.- p. 39-40.
  14. Noguera –Oueoros A. Lutsche C., Capron M., Dessaint I.P., Capron A. Delection and quantification of circulationg antigen in antibody // Clin. And Exp. Immunol. -1986/65. -№ 2. –Р. 223-231.
  15. Маканова А.Г. Биологические особенности личинок родов Gastrophilus, Rhinoestrus и иммунодиагностика ларвальных энтомозов лошадей.: Автореф. дисс. канд.биол.наук. -Алма-Ата, 1989. 21 с.
  16. Аязбаев Д.М. Иммунологические аспекты паразитохозяинных отношений при эстрозе овец и меры борьбы.: Дисс.канд.биол.наук. -Алма-Ата, 1990. 118 с.
  17. Алпаев Н.С. Иммунологические особенности личинок верблюжьего овода и паразитохозяинные отношения при цефалопинозе.: Дисс. канд. биол. наук. -Алма- Ата, 1992. 111 с. 
Фамилия автора: Шабдарбаева Г.С., Балгимбаева А.И.
Год: 2011
Город: Алматы
Яндекс.Метрика