Аннотация. Из различных экологических ниш (почва, морская вода) выделены и идентифицированы культуры каротинсодержащих дрожжей. Выделение и поддержание выделенных культур осуществляли на универсальных агаризованных средах, для отработки процесса глубинного культивирования использовали жидкие питательные среды (без добавления агара). По результатам исследования выделенные культуры Rd1, Rd3, Rdv1, Rdv2, Rdv3, Rdi1, Rdr1, Rdb1 идентифицированы как Rhodoturola glutinis.
Некоторые дрожжи способны синтезировать широкий спектр каротиноидов, обладают способностью в процессе ферментации накапливать достаточное количество биомассы. Эта группа эукариотных микроорганизмов может занять прочные позиции в современной биотехнологии, в том числе и в области микробиологического синтеза каротиноидов [1]. Каротиноиды представляют собой класс пигментов, которые имеют важные биологические функции. В организме человека каротин является предшественником витамина А. Некоторые дрожжи (Cryptococcus, Phaffia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Sporidiobolus, и Sporobolomyces) как сообщается, производят каротиноиды [2]. Производство каротиноидов из дрожжей рода Rhodotorula зависит от вида, средне составляющих и условий окружающей среды. Продуктивность микроорганизмов Rhodotorula sp. может быть низкой (менее 100 мкг на 1 г), средней (от 101 до 500 мкг на 1г) и высокой (более 500 мкг на 1 г) [3].
К каротиноидам относятся более 600 пигментов, которые синтезируются в высших растениях, водорослях, бактерияхигрибках. Структура каротиноидов близка к ликопину. Большинство из каротиноидов циклические углеводы, состоящие из 40 атомов углерода [4].
Красные дрожжи, в том числе Rhodotorula sp. способны накапливать не только каротиноиды, но и эргостерин, ненасыщенные жирные кислоты, коэнзим Q10 и другие вещества, которые могут внести вклад в обогащение биомассы. Использование микробной биомассы в комбикормовой промышленности может иметь положительный эффект не только в кормах для животных и рыб из-за высокого содержания физиологически активных веществ, а также может повлиять на питательную ценность и органолептические свойства конечного продукта для питания человека [5].
Цель работы – выделить активные каротинсодержащие дрожжи из объектов внешней среды.
Материалы и методы исследования
Объект исследования – каротинсодержащие дрожжи, выделенные из каштановой почвы Северо- Казахстанской области и морской воды.
Выделение и поддержание выделенных культур осуществляли на универсальных агаризованных средах, для отработки процесса глубинного культивирования использовали жидкие питательные среды (без добавления агара):
Накопительная среда для выделения, г/л: фосфат калия однозамещенного - 6,3; ЭКД - 5,0; сульфат магния семиводный- 7,4; глюкоза - 10,0. Для создания элективных условий в среду добавляли ампициллин 500 ед/л.
Среда Ридер, г/л: фосфат калия однозамещенного – 6,3; сульфат аммония - 2,7; сульфат магния семиводный - 7,4; глюкоза - 55,0; дрожжевой автолизат – 5,0.
Выделение каротинсодержащих дрожжей проводили методом накопительных культур [6].
Для установления семейства, рода, вида, к которому принадлежат выделенные в чистые культуры дрожжей, изучили их морфологические, культуральные и физиологические признаки.
Оценивали рост в жидкой сусло-среде: образование пленки на поверхности среды, адгезию микроорганизмов к стенкам пробирки, формирование осадка в 30-суточной культуре; изучали форму клеток и способ вегетативного размножения в 3-суточной культуре, размеры клеток. Физиолого-биохимические свойства оценивали по ассимиляции источников углерода, температурным границам роста (рост при 25, 30, 60°C), тесту на уреазу (для видовой идентификации дрожжевых грибов) [7].
Для определения каротиноидов использовали спектрофотометрический метод, содержание β-каротина, торулина и торулародина в экстрактах из биомассы дрожжей Rhodoturola glutinis определяли при длинах волн 450 нм, 509 нм, 537 нм [8].
Результаты и обсуждение
Выделили штаммы каротинсодержащих дрожжей из различных природных источников (почва, морская вода). Для выделения использовали накопительную среду. Для создания элективных условий в среды добавляли ампициллин 500 ед/л. Колбы устанавливали на качалке при режиме культивирования: 28 °С, 220 об/мин, 96 ч. По истечении срока культивирования была отмечена выраженная пигментация КЖ в колбах, по микроскопии отмечено наличие дрожжевых клеток. При росте визуально отмечено помутнение, биомасса красно-оранжевого цвета. Проведены истощающие рассевы с целью получения отдельных изолятов. Выделили 5 моноизолятов каротинсодержащих дрожжей из почвы, 3 моноизолята из морской воды.
Выделены 5 моноизолятов каротинсодержащих дрожжей из каштановой почвы, 3 моноизолята– из морской воды.
Рисунок 1 – Истощающий рассев каротинсодержащих дрожжей
Изучили культурально-морфологические свойства выделенных моноизолятов. Культуры на плотных средах образуют округлые колонии по консистенции слизистые, образуют пигменты, окрашивающие их колонии в различные цвета. Наличие каротиноидных пигментов, придающих колониям красную, розовую, оранжевую или желтую окраску, характерно для дрожжевых микроорганизмов родов Rhodotorula, Sporobolomyces, Cystofilobasidium и др.
При росте на жидких средах дрожжи вызывают равномерное помутнение, образуют осадок, пленку на поверхности среды. Кроме того, дрожжевые культуры способны к адгезии на стенках пробирки на границе питательной среды и воздуха.
Изучены морфологические свойства моноизолятов: клетки круглые, овальные, размер колоний - точечный, край волнистый, цвет колоний красный, розовый, кирпичный, колонии слизистые. Изучаемые изоляты баллистоспоры не образуют. Физиолого-биохимические свойства изучаемых штаммов представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Физиолого-биохимические свойства штаммов
У выделенных моноизолятов микроорганизмов рост наблюдается при температуре от 19-36ºС, оптимальной для культивирования является температура от 30 °С. Органолептические показатели и физико-химические показатели каротинсодержащих дрожжей определяли по специальным методикам в соответствии с действующим ГОСТом 20083-74 «Дрожжи кормовые. Технические условия». Согласно физиолого-биохимическим характеристикам отнесли выделенные изоляты к роду Rhodotorula. Таким образом, из проб почвы и морской воды были выделены 8 штаммов каротинсодержащих дрожжей, принадлежащие к роду Rhodotorula.
Выделенные штаммы проверили на продуктивность каротиноидов. Для этого провели ферментацию на колбах со средой Ридера. Условия культивирования дрожжевой культуры: температура 30°C, скорость вращения на качалке (180-200 об/мин), 96 часов, рН – 5,5-6,5. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2 – Продуктивность каротинсодержащих дрожжей
Наибольшую продуктивность β-каротина показал штамм каротинсодержащих дрожжей Rhodoturola glutinis Rd1, β-каротин составил 0,36 мкг/мл. Отобранный активный штамм перспективен при разработке кормовой добавки на основе каротинсодержащих дрожжей.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Sandman G. Carotenoid Biosynthesis and biotechnological application // Archives of Biochemistry and Biophysics. – 2001. – №1. – PР. 4-12.
- Verwaal , Jing Wang, Meijnen J., Visser H., Sandmann G., van den Berg J. High-Level Production of Beta-Carotene in Saccharomyces cerevisiae by Successive Transformation with Carotenogenic Genes from Xanthophyllomyces dendrorhous // Applied and Environmental Microbiology. – 2007. – № 7. - РP. 4342–4350.
- El-Banna A., Abd El-Razek A., El-Mahdy A. Isolation, Identification and Screening of Carotenoid- Producing Strains of Rhodotorula glutinis. // Food and Nutrition Sciences. – 2012. – № 3. – РР. 627-633.
- El-Banna A., Abd El-Razek A., El-Mahdy A. Some Factors Affecting the Production of Carotenoids by Rhodotorula glutinis glutinis // Food and Nutrition Sciences. – 2012. – №3. – РР. 64-71.
- Ivana Marova, Andrea Haronikov, Sinisa Petrik, Terezie Dvorakova, Emilia Breierova. Production of enriched biomass by red yeasts of sporobolomyces sp. grown on waste substrates // Journal of Microbiology and Biotechnology. – 2012. – № 1 (4). – РP 534-551.
- Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии: учебное пособие для студентов высших учебных заведений. – М.: Изд. центр Академия, 2005. – С. 217-320.
- Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей. – М.: Пищевая промышленность, 1979. – 120 с.
- Вечер А.Л., Куликова А.Н. Спектрофотометрическое определение содержания каротиноидов в биомассе микроорганизмов / Физиолого-биохимические исследования растений. – Минск, – С. 44-54.