Особенности и механизм действия иммобилизованных биологических объектов

 В статье приведены результаты научных исследований процесса иммобилизации культур микроорганизмов для увеличения выживаемости пробиотических культур в молочных продуктах. 

Иммобилизованные биологические  объекты  можно  рассматривать  как  отдельную  отрасль  создания и использования биологических объектов.

Иммобилизованный объект представляет собой гармоничную систему, действие которой в целом определяется  правильным   подбором   трех   основных   компонентов:   биологического   объекта,   носителя и способа связывания объекта с носителем.

Теоретические   основы   иммобилизации   заложены   в   трудах   отечественных   и   зарубежных ученых  -  Д.В. Ганиной,  А.М.  Аксуповой,   Ю.А.  Синявского,   Дж.  Вудворда,   П.   Марек,  Дж.   Кристен, П. Кафлэн    и др.

В основном используются следующие группы методов иммобилизации биологических объектов:

  • включение в гели, микрогранулы,микрокапсулы;
  • адсорбция на нерастворимых носителях;
  • ковалентное связывание с носителем;
  • сшивка бифункциональными реагентами без использования носителя;
  • «самоагрегация» в случае интактных клеток.

Основными преимуществами использования иммобилизованных биологических объектов являются:

  • высокая активность;
  • возможность контроля над микроокружением агента;
  • возможность полного и быстрого отделения целевых продуктов;
  • возможность организации непрерывных процессов с многократным использованием объекта.

Следует особо выделить группу биологических объектов: ферменты-катализатор биологического происхождения, изучением которых в прикладном аспекте занимается инженерная энзимология. Основная ее задача - разработка биотехнологических процессов каталитического действия энзимов, как правило, выделенных из состава биологических систем или находящихся внутри клеток, искусственно лишенных способности роста [1].

Благодаря ферментам скорость реакций, по сравнению с реакциями, протекающими в отсутствии этих катализаторов, возрастает в 106-108раз. Как следует из вышеизложенного, в биотехнологических процессах возможно использование ряда биологических объектов, характеризующихся различными  уровнями сложности биологической регуляции, например клеточным, субклеточным, молекулярным. От особенностей конкретного биологического объекта самым непосредственным образом зависит подход к созданию всей биотехнологической системы в целом. В результате научных исследований расширяются возможности прикладного использования той или иной биологической системы в качестве активного начала биотехнологического процесса. Набор биологических объектов в процессе научных исследований непрерывно пополняется.

Коадгезия прокариот является общебиологическим свойством и обеспечивает эндотрофной микрофлоре биотопов (ЭМБ) селективное преимущество. Идея создания иммобилизованных пробиотиков (ИП) основана на этой основе. К иммобилизованным относят пробиотики, в состав которых входит эубиотическая микрофлора (ЭМ) и вещества, обладающие сорбционным эффектом к ней. ЭМ могут быть соадгезированы (иммобилизованы) на частицах материала или коадгезированы с его помощью. Заметим, что видовой специфической адгезии в отношении конкретного сорбента не  существует.

Формирование и сохранение микробиоценозов поэтапно включает:

  • передачу ЭМБ от донора к реципиенту, коадгезию или соадгезию микроорганизмов во внешней среде, образование бактериальных агрегатов, имеющих необходимую биологически дееспособную дис- кретную плотность (БДДП);
  • гистадгезию бактерий  в  пристеночном,  или  соадгезию  в  полостном,    микробиотопе;     колонизацию и расселение ЭМБ по ярусам биотопа;
  • реализацию  репродуктивного,   затухающего   или   поддерживающего   колонизационного   процесса в системе тканевых популяционкых циклов и замкнутых посевных контуров.

Использование ИП позволяет исключить этап 1 и усилить эффективность этапов 2, 3.

Механизм действия ИП складывается из взаимодействия конгломератов (адгезированные на сорбенте ЭМ) с каким-то множеством локальных площадок слизистой поверхности биотопа (пристеночного микробиотопа). Вероятность возбуждения гистадгезии ЭМ на локальных площадках зависит от физико- химических факторов среды, морфологической характеристики производственного штамма, электростатики и гидрофобности функциональных групп и структуры поверхности сорбента. Количество клеток, архитектоника конгломерата, другие свойства должны удовлетворять  требования  к реплика-ционной дозе или БДДП. Противодействуют или способствуют развитию популяции в биотопе лимитирующие, стимулирующие, прото - кооперативные, экологические и социальные факторы, поэтому вероятность клинически эффективной колонизации зависит от числа возбужденных дискретных площадок. Например, конгломерат, состоящий из 20 клеток бифидобактерий с площадью проекции 70-100 мкм2 (БДДП-0,28-0,2) придает максимальную возможность локальной гистадгезии. Вероятность развития поддерживающего процесса колонизации биотопа составляет 31,6% при возбуждении 10 дискретных площадок и  повышается до 82-91% при 10 дискретных площадок. При диффузном распределении клеток ЭМ в  биотопе,  его ярусе или микробиотопе вероятность создания БДДП значительно ниже и в основном зависит от свойств химуса или других возможностей агрегирования [2].

На модели кишечного биотопа новорожденных поросят изучали особенности колонизации  кишечника при изменении количественной и качественной характеристик вводимых доз бифидобактерий. Для этого иммобилизированные на активном угле Bifidobacterium bifidum (биомасса «Бифидумбактерина форте») вводили : а) одноразово в мегадозе 1,0-1010 микробных клеток и б) по 3,0 • 107 в течение  трех  дней. Животных вскрывали через сутки после введения препарата. Результаты колонизации оценивали количественными посевами слизистой и прилегающего к ней химуса.

При введении мегадозы распределение бифидофлоры по биотопу представило: слепые кишки 1,08-3,2-107 МК/ мм2 слизистой поверхности и 3,1-4,3-109 МК/мг химуса; дистальный отдел подвздошной кишки - 6,75-8,2-106 МК/ мм2, 5,1-6,3-107 МК/мг; средний отдел толстой кишки - 3,6-5,2 • 105 МК/мм2, 1,1-3,0-108 МК/мг. Слизистая оболочка двенадцатиперстной кишки содержала 2,8-6, 4-103 МК/мм2. При трехдневном  введении  поросятам  биомассы  в слизистой  слепых  кишок  обнаружено  7,8-9,1-102  МК/  мм2 и в химусе 1,2-10 МК/мг бифидобактерий. При расчете уровней колонизации (УК) слизистой поверхности учитывали, что для покрытия ее в один мультислой требуется 1,0-1,2-106  МК.

Из полученных данных можно сделать вывод, что основной экологической нишей бифидофлоры являются   пристеночные   микробиотопы   слепых   кишок   и   дистальные    отделы    тонкого   кишечника (УК = 900 и 583%, соответственно 9 и 6 мультислоев). Одновременно прослеживается рассредоточение бифидобактерий по всему кишечному биотопу. УК слизистой оболочки слепых кишок при трехдневном введении препарата не превысил 1%, при этом бифидобактерий размещались дискретно в виде микроколоний. Введение мегадозы позволяет считать максимальным, для данной модели, насыщение сли- зистой поверхности не более 3,2-107 МК/мм2. Полостной микробиотоп слепых кишок, после освобождения от излишней бифидофлоры, содержал не более 1,5% от пристеночной концентрации  [2].

Результаты экспериментов позволяют думать о возможности изменения подхода при искусственном формировании микробиоценоза по компоненту бифидобактерий. Так, введение увеличенных, по   сравнению с рекомендуемыми, доз иммобилизированных бифидобактерий, за короткий промежуток времени, вероятно, позволит быстрее сформировать необходимый уровень этого ценобионта в кишечном микробиоценозе.

Пробиотики - живые микроорганизмы, которые транзитом поступают в ЖКТ и эффективно защищают организм от многих канцерогенов и токсинов, угнетают патогенную микрофлору, синтезируют некоторые витамины, улучшают утилизацию лактозы, абсорбцию кальция, адаптацию белков, а также выполняют ряд других функций в организме человека. Потребность в пробиотических кисломолочных продуктах для профилактики различных заболеваний у людей, проживающих в условиях неблагоприятной экологической среды, возрастающей стрессовой нагрузки, гиподинамии, с избыточной массой тела объективно возросла. Пробиотические свойства микроорганизмов зависят от их способности выживать и размножаться в условиях желудочно-кишечного тракта. Бактерии должны быть метаболически стабильными и активными не только в продуктах, но и оказывать благоприятный эффект на  организм  человека.  Для  обеспечения функциональных свойств минимальный уровень жизнеспособных клеток должен составлять 10 КОЕ/см продукта в течение всего  срока  годности,  а терапевтическая  доза  –  106  жизнеспособных  клеток  в  день. Но   в настоящее   время   имеется   тенденция   к увеличению   норм   потребления   пробиотических  культур, и в некоторых странах Западной Европы минимальный уровень клеток повышен до 107  КОЕ/см.

Однако исследования показывают, что значительная часть пробиотических  культур,  обладающих такими важными свойствами, как антагонистическая и антиоксидантная активность, витаминосинтезирующая способность, проходя через желудочно-кишечный тракт, погибает. Количество клеток   пробиотических   культур   в   замороженных   ферментированных   молочных   продуктах   йогуртов и пудингов   значительно   уменьшается   под   действием   кислотности,   повреждений   при замораживании, влиянием сахара и кислорода (количество клеток уменьшается на 5-6 1оg в течение 8-12 недель при -18°С). В этой связи большой интерес вызывают исследования по совершенствованию и разработке новых способов поддержания жизнеспособности клеток в неблагоприятных условиях [3]. Основные  преимущества смешанных культур, по сравнению с монокультурами, следующие:

  • способность утилизировать сложные, неоднородные по составу субстраты, зачастую непригодные для монокультур;
  • способность к минерализации сложных органических соединений;
  • повышенная способность к биотрансформации органических веществ;
  • повышенная устойчивость к токсичным веществам, в том числе тяжелым металлам;
  • повышенная устойчивость к воздействию окружающей среды;
  • повышенная продуктивность;
  • возможный обмен генетической информацией между видами сообщества.

Существует ряд подходов, увеличивающих жизнеспособность клеток, к которым относятся селекция кислотно- и желчерезистентных штаммов, использование непроницаемой упаковки, двухстадийная ферментация, стрессовая адаптация, введение микронутриентов (цистеин, сывороточный порошок, кислотный гидролизат казеина), бифидогенных факторов (лактулоза и олигосахариды). Такие подходы несколько увеличивают потенциальную выживаемость бифидокультур. Изменение в процессе производства молочного йогурта, приостановление ферментации при рН (5,0±0,1) может обеспечить выживаемость биокультур, но конечный продукт не будет обладать характерным вкусом и ароматом   [3].

Для увеличения выживаемости клеток пробиотических микроорганизмов может использоваться гранулирование и капсулирование как в биотехнологических процессах, так и в организме человека. Технология гранулирования и капсулирования пробиотических клеток базируется на технологии иммобилизованных клеточных культур, используемой в биотехнологии. В  этом  направлении  уже проводились исследования, показавшие успешное использование гранулирования и капсулирования микроорганизмов с помощью различных пищевых полимеров. Например, внешняя оболочка микрокапсулы представляет собой тонкую непроницаемую для клеток, но проницаемую для растворимых веществ (нутриентов и метаболитов для обеспечения роста капсулированных клеток), искусственную мембрану,   что и   позволяет    отнести   микрокапсулирование    к   методам    иммобилизации   клеток      с    использованием «мембранной технологии» [3].

Имеются   данные   применении   для    микрокапсулирования    пробиотических  микроорганизмов каппа  -  карагинана,  гуммиарабика,  желатина,  альгината  натрия,  крахмала,  эмульсии  кунжутного   масла и других веществ. Важным фактором, влияющим на выживаемость клеток бактерий,  является состав веществ, применяемых для образования капсул, и их размер. Так, при капсулировании пробиотических культур с использованием альгината и хитозана (Syeu T Y Marshall R T) полученные капсулы эффективно защищали клетки микроорганизмов,  тогда  как популяции  свободных  клеток  погибали при  выдерживании в условиях повышенной кислотности в течение 1 ч. Hou R C W и Lin M Y показали, что жизнеспособность молочнокислых  бактерий  значительно  увеличивается  (более  чем  в  200  раз)  при  капсулировании  клеток в эмульсию искусственного масла. Для формирования капсул или гранул с иммобилизованными клетками существует два основных подхода: диспергирование и гранулирование  [1].  В  первом  случае водная суспензия  клеток  диспергируется  в  несмешивающейся  с ней  органической жидкости,  а присутствующие в системе специальные добавки образуют на поверхности капелек водной фазы  мембранную  пленку. Размеры капсул регулируются скоростью агитации, могут быть очень разнообразными - от 25 мкм до 2 мм. Во втором случае водная суспензия клеток через особое  дозирующее  устройство  (гранулятор) инжектируется порциями строго определенного объема также в несмешивающуюся с водой органическую жидкость, где на границе раздела фаз по поверхности водной капли происходит  формирование микрогранулы.  Размеры микрогранул   при использовании данного метода  достигают  от  2 до 5 мм.  И   тот, и другой методы способствуют увеличению выживаемости пробиотических бактерий до 80-95%. Изучение кинетики кислотообразования капсулированных микроорганизмов в биотехнологических процессах показывает, что скорость образования кислоты ниже по сравнению с использованием свободных микроорганизмов.

Применение гранулирования и капсулирования для пробиотических и молочнокислых культур дает ряд преимуществ   -    защита    клеток    от    бактериофагов,    увеличение    выживаемости    в    процессе  сушки и замораживания,  увеличение   стабильности  свойств  стартовых  культур   и  готовых  продуктов    питания в процессе хранения. Следовательно, капсулированные и гранулирование клетки пробиотических микроорганизмов целесообразно применять для получения обогащенных продуктов. Наибольший интерес представляют исследования  по  включению  клеток  пробиотических  микроорганизмов  в растительные и водорослевые полисахариды (пектин, альгинат, агар) и белковый продукт – желатин. Молекулы полисахаридов  составлены  из  атомных  группировок,  резко различающихся  по характеру взаимодействия с молекулами воды.  Длинная макромолекула  представляет собой распределение центров    взаимодействия с молекулами воды, в результате чего создается гидратная оболочка макромолекулы. 

Для скрининга проведен сравнительный анализ предполагаемых носителей. Агар – полисахарид сложного состава из морской водоросли анфельции, в сильной степени поперечносшитый. Образует студни после охлаждения до температуры 32-39 ºС. Иммобилизацию в гели агара проводят с использованием термофильных культур микроорганизмов. Пектины являются основными представителями группы гетерогликанов высших растений. Основным представителем пектиновых веществ является полигалактуроновая кислота. Остатки галактуроновой кислоты, как правило, этерифицированы метанолом.

Образование гелевой структуры в растворах пектинов происходит в результате взаимодействия пектиновых молекул между собой и зависит от особенностей строения молекулы. Кроме этого, на процесс гелеобразования оказывают влияние температура, рН среды и содержание дегидратирующих веществ. Пектины являются природными ионообменниками, способными замещать водороды карбоксильных групп на катионы поливалентных металлов. Кроме того, использование пектина в качестве носителя при иммобилизации, обладающего способностью вывода из организма соли тяжелых металлов,  позволяет решить проблему профилактического питания для групп населения, проживающего в промышленно развитых городах.

Желатин – белковый продукт, представляющий собой смесь полипептидов с различной молекулярной массой, не имеющий вкуса и запаха. Он растворяется в горячей воде, при охлаждении водные растворы образуют студень. Растворы желатина имеют низкую вязкость, которая зависит от рН. Условиями образования геля желатина являются его достаточно высокая концентрация  и соответствующая температура, которая должна быть ниже точки затвердевания (30 ºС) [2].

Данные исследования по иммобилизации пробиотических культур  микроорганизмов  методом включения их в гели агара, пектина и желатина методом гранулирования и капсулирования, также использованию    иммобилизованных    пробиотических    культур     микроорганизмов    для     ферментации и производства новых кисломолочных, молочно-растительных и десертных продуктов проводятся учеными кафедры «Прикладная биотехнология» в лабораториях «Микробиология и биотехнология» и «Экспертиза качества биосистем» Центра инновационных технологий Инновационного Евразийского   университета.

 

Литература

  1. Иммобилизованные клетки и ферменты: методы / Под ред. Дж. Вудворда. - МС.: Мир, 1988. - 215 с.
  2. Влияние дозы иммобилизованных бифидобактерий на механизм колонизации кишечного биотопа // Пробиотические микрорганизмы — современное состояние вопроса и перспективы использования: тез. докл. межд. науч.-практ. конф. памяти Г.И. Гончаровой. - М., 2002. - С. 28-29.
  3. Гаврилова Н.Б. Биотехнология комбинированных молочных продуктов: Монография. - Омск: Сибирь, 2004. - 224 с. 
Фамилия автора: Т.А. Назаренко
Теги: Биология
Год: 2012
Город: Павлодар
Категория: Биология
Яндекс.Метрика