Цитологическая картина изменений в очагах поражения при хроническом рецидивирующем герпетическом стоматите.

Резюме: При различных формах(везикулярной, некротической и инфильтративно-язвенной) рецидивирующего герпетического стоматита определены цитопатологические изменения в клеточных популяциях. При везикулярной форме цитопатогенный эффект(ЦПЭ) проявлялся увеличением ядер клеток(4.5%), мелкоглыбчатым распадом ядер(3.75%), вакуолизацией цитоплазмы(2.25%), некротизацией клеток(3.5%). Выявилось двухядерные клетки(1%). Количество клеток подверженных цитопатическому воздействию вируса было заметно больше при некротической форме герпетического стоматита чем при остальных формах.

Среди заболеваний слизистой оболочки полости рта (СОПР) красной каймы губ (ККГ) герпетическое поражение занимает определенный удельный вес. По данным ВОЗ около 90% жителей земного шара, заражены вирусом простого герпеса, а у 25%30% из них имеют место клинические проявления болезни, которые распознаются несвоевременно изза чего возможно запоздалая диагностика. Как мы установили, при не правильной диагностике и отсутствии своевременных рациональных лечебных мер болезнь часто рецидивирует, течение становится продолжительным и тяжелым вызывая различные осложнения в организме, вплоть до хронической вирусогенной сенсибилизации и интоксикации [6], обусловливающие возникновения аутоиммунных заболеваний как пузырчатка и красный плоский лишай.

Для правильного выбора методов и средств лечения хронической вирусной инфекций необходимо определить формы проявлений, тяжесть болезни и специфику поражения тканей СОПР. Для выполнения этих задач определенную роль играет цитологический метод исследования, который остается перспективным методом. Цитологический метод нашел широкое применение в различных областях клинической медицины и хорошо зарекомендовал себя в онкостоматологии {1}, при диагностике герповирусной инфекций и при заболевании внутренних органов {3, 5} и кожи.

Ранние для определения особенностей клинического течения герпетических поражений СОПР нами был использован цитологический метод исследования и на оснований изучения цитоморфологической картины изменении в очагах поражения были определены три формы заболевания: везикулярная, некротическая и инфильтративноязвенная [ 2 ].

Целью настоящего исследования явились изучение цитопатологических изменений в клеточных популяциях при выше указанных 3-х формах хронического рецидивирующего герпетического стоматита.

Материал и методика исследования: в качестве объекта исследования служили мазки-отпечатки с очагов эрозии и язв у больных с хроническим рецидивирующим герпетическим стоматитом.

Препараты окрашивали по методике Паппенгейма: фиксировали 1% раствором метиленового синего на метаноле ( по Май-Грюнвальду) и докрашивали азурэозином по Романовскому Гимза.

Вначале проводили обзорную микроскопию препаратов с окулярами х10 и х20 (увеличение 150 и 300 раз). Затем под объективом х90 (увеличение 1350 раз) проводили количественный подсчет клеточных элементов.

В мазках описывали фон (характер межтканевой жидкости, составляющей основу экссудата), наличие эритроцитов, бактерий, грибков. Элементы воспалительного инфильтрата были представлены нейтрофильными лейкоцитами, лимфоцитами, моноцитами, эозинофильными лейкоцитами. Степень функциональной активности нейтрофилов мы отмечали, опираясь на описанные Федотовских Г. В. и Жолмухамедовым К.К признаками:

1. разрушающиеся гранулоциты
2. нейтрофилы с признаками повышенной мембранной активности, сочетавшейся с признаками деструкции.
3. нейтрофилы с признаками умеренной выраженной активностью
4. лейкоциты без признаков функциональной активности Нормальные клетки отмечали согласно предложенным D. E. Lange степеням дифференцировки эпителиоцитов:
5. базальные клетки
6. парабазальные клетки
7. промежуточные клетки 1-го типа (близкие парабазальным)
8. промежуточные клетки 2-го типа (близкие поверхностным )
9. поверхностные клетки
10. безъядерные клетки (ороговевшие безъядерные чешуйки)

Для наиболее полного и объективного отражения цитологической характеристики отпечатков слизистой оболочки полости рта подсчитывали индекс дифференцировки клеток ( ИДК) по формуле, предложенной Быковой И.А. с соавторами: ИДК= 1а+ 2б+ 3в +4г+ 5д+ 6е

Где 1, 2, 3, 4, 5, 6цифровые обозначения описанных выше стадий дифференцировки клеток; а, б, в, г, д , епроцентное соотношения клеток соответствующей стадии дифференцировки. Как известно, ИДК для слизистой оболочки полости рта здоровых людей ориентировочно равен: 4х10+ 5х40+ 6х50+=540.в норме он может колебаться в пределах 500-560 при воспалительных процессах он снижается, при гиперкератозах повышается.

Особый интерес представляли клетки, трансформированные под воздействием вируса. Из литературных источников известны следующие варианты проявления цитопатического эффекта (ЦПЭ) вызванного герпевирусом: увеличение размеров ядер, баллонирующая дегенерация ядра и внутриядерные включения; мелкоглыбчатый распад ядра; вакуолизация цитоплазмы; внутриклеточные базофильные включения; появление клеток неправильной формы; образование многоядерных клеток( 2 и более ядра); некротизация клеток. Все эти признаки были заложены в рабочую таблицу, в которой отмечалось число клеток, имеющих указанные изменения.

Результаты исследования:

Цитограммы при различных формах рецидивирующего герпетического стоматита имели общие черты. Прежде всего , это наличие межуточного вещества (межтканевой жидкости), заполняющей герпетический пузырек, который образовался при везикулярной форме заболевания. Это жидкость образовывала малиновый фон или образовывал сгущения в виде тяжей или хлопьев. В большем или меньшем количестве обнаруживались свежие эритроциты. Всегда присутствовали бактерии: кокки, палочки, иногда нитчатые бактерии рода Leptotrix , грибы рода Candida.

Эпителиальный компонент был представлен клетками плоского эпителия различных слоев в зависимости от глубины поражения слизистой. На клетках верхних слоев 5-ой и 4-ой степени дифференцировки , наблюдалась контаминация бактерий Необходимо отметить различия в цитограммах, связанные с методикой забора материала. Если материал получали методом отпечатка, то в препарате отмечалось больше поверхностных клеток, чем в соскобе. Возможно, этим объясняется высокий ИДК при некротической форме стоматита, когда мы изучали мазки отпечатки.

Воспалительный инфильтрат состоял из нейтрофильных лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов и макрофагов, редких эозинофилов. Нейтрофилоциты были различных форм: в состоянии выраженной деструкции; с признаками функциональной активности, проявляющейся увеличением размеров клеток (ядра и цитоплазмы), образованием лопоподий и вакуолей; инертные нейтрофилоциты были мелких размеров, округлой формы, с плотным ядром. У разных больных были разные проявления фагоцитарной функции нейтрофилов от редких экземпляров, фагоцитирующих единичные

Таблица 1 бактериальные тела до нейтрофилов, цитоплазма которых переполнена бактериями. Лимфоидные элементы были преимущественно в виде лимфоцитов (больших и мелких), лимфобласты встречались гораздо реже. Довольно часто обнаруживались моноциты и скопления макрофагов. Встречались макрофаги, фагоцитирующие нейтрофилоциты В результате углубленного анализа с подсчетом клеточных элементов определены четкие различия цитограмм при везикулярной, инфильтративноязвенной и некротических формах герпетического стоматита (таблица 1)

Как видно из таблицы, при везикулярной форме мазок был мало – или умеренно клеточный. По краям отпечатка захватывались безъядерные чешуйки и нормальные поверхностные эпителиоциты. Жидкость, наполняющая герпетический пузырек, в масках создает довольно равномерно малиновый фон разной интенсивности. Середину отпечатка занимало межтканевая жидкость, в которой имелись малочисленные эритроциты, небольшое количество бактерий, эпителиальные клетки.

Нормальные клетки были преимущественно верхних слоев, 5и 4 степеней дифференцировки:

1 – 0

2 – 0

3 – 6,25%

4 – 29% ИДК = 3х6,25+4х29+5х48,5+6х16,25=474,75

5 – 48,5%

6 – 16,25%

ИДК=474,75 что было ненамного ниже нормы. Около 10% нормальных клеток были контаминированы бактериями. Бактерии также находились в виде скоплений и в небольшом количестве были фагоцитированы отдельными нейтрофилами. Вирус – трансформированные клетки составляли не более 10 – 19%, в среднем 16% от эпителиального компонента.

При некротической форме мазок отличался высокой клеточностью, основную массу составляли элементы воспаления. Межтканевая жидкость лежала неравномерно, иногда хлопьями, образовывала волокнистые сгущения. Отмечалось большое количество эритроцитов (до 30 – 50 в поле зрения). Обсемененность бактериями была умеренной, около 20% нормальных клеток верхних слоев были адгезированы бактериями. У 1 больного обнаружены фрагменты мицелия грибов рода Candida.

Эпителиальный компонент отличался большим разнообразием. Нормальные клетки были как поверхностного и промежуточного, так и более глубоких слоев:

Таблица 2.

1 – 0%

2 – 7%

3 – 34.75%

4 – 42,25% ИДК= 2х7+3х34,75+4х42,25+5х14,75+6х2=373

6 – 2%

ИДК= 375 что значительно ниже нормы и этого же показателя при везикулярной форме стоматита, что подтверждает более глубокое поражения эпителия при некротической форме.

Процент клеток с проявлениями ЦПЭ был самым высоким в среднем, 51,25%. Имелись клетки типа фиброцитов. Их число было в несколько раз больше, чем при везикулярной и инфильтративно – язвенной форма стоматита.

При инфильтративно язвенной форме мазки имели обильный клеточный состав. Жидкости почти не заметно, имелись редкие тяжи фибрина. Основную массу клеточных элементов составляли нейтрофилы, моноциты и макрофаги, а также лимфоциты. Бактерии обнаруживались в умеренном количестве. Эритроциты имелись во всех полях зрения по несколько экземпляров (3-7).

Эпителиальный компонент представлен клетками плоского эпителия всех слоев, включая базальные

1 – 9,5%

2 – 28,58%

3 – 25,54%

4 – 24,31% ИДК –

1х9,5+2х28,58+3х25,54+4х24,31+5х9,35+6х2,76=303,83

5 – 9,35%

6 – 2,76%

7 – 2,76%

ИДК = 304, это самый низкий показатель из трех форм стоматита. Число клеток с ЦПЭ составило 33,6% от всех эпителиоцитов.

Различия в цитограммах отмечались не только в количестве вирус –трансформированных клеток, но и в проявлении ЦПЭ (таблица 2):

Как видно из таблицы 2 при везикулярной форме стоматита ЦПЭ проявлялся большой степени увеличением ядер (4,5%), мелкоглыбчатым распадом ядер (3,75%) вакуолизацией цитоплазмы (2,25%), некротизацией клеток (3,5%). Выявлялось небольшое количество двуядерных клеток (1%). Клетки с числом ядер более 2-х не обнаружены.

При некротической форме чаще выявлялись вышеперечисленные проявления ЦПЭ: ядро увеличены 7,75% клеток, мелкоглыбчатый распад ядер наблюдался 11,25%, вакуолизация цитоплазмы имела место у 6,75%, 2-ядерные клетки были видны в 7 раз чаше чем при везикулярной форме (6,75%). Несколько больше, чем при инфильтративно – язвенной форме стоматита было число клеток неправильной формы

Таблица 3 (2,25% ) и клеток с числом ядер более 2 – х (2%).

При инфильтративно язвенной форме стоматита проявления ЦПЭ имели 33,4% эпителиоцитов. При этом клетки с увеличенными ядрами составляли уже 10,5%, по 2 ядро имели 6,13% от числа всех клеток плоского эпителия. Проявлялись клетки неправильной формы (2,12%) и много ядерные клетки (1,11%).

Выявлялись различия и в характере воспалительного инфильтрата (таблица 3). Прежде всего, соотношение между эпителиальным и воспалительном компонентом в случае везикулярного стоматита было примерно 10 лейкацитов на 1 эпителиоцит, при некротическом и инфильтративно-язвенном 30-50 лейкоцитов на 1 эпителиоцит.

При везикулярной форме стоматита воспалительный инфильтрат содержал в среднем 55,6% нейтрофильных лейкоцитов, 17,13% лимфоцитов и 26,0% моноцитов и макрофагов, имелись редкие эозинофилы (1,1%). Нейтрофилы и лимфоциты имели признаки функционально активации. Они были крупных размеров с большим количеством цитоплазмы, в отдельных имелись вакуоли и выросты цитоплазмы в виде лобоподий.

При некротической форме основную массу препарата составляли нейтрофильные лейкоциты (84,5%). Нейтрофилы были в основном с деструктивными изменениями в состоянии распада или мелкие округлые инертные формы. Лейкоциты составляли 10,25% от инфильтрата, моноциты и макрофаги5,25%.

При инфильтративно-язвенной форме процент нейтрофилов был несколько больше (62,53%). При этом отмечалось большое число активных фагоцитирующих лейкоцитов. Лимфоцитов было немного (7,48%), но было увеличено число моноцитов и макрофагов (28,8%). Этот показатель был самым высоким в трех группах.

Как видно из вышеописанного, при везикулярной форме стоматита был меньше процент нейтрофильных лейкоцитов за счет увеличения процента лимфоцитов и моноцитов. Характер инфильтрата говорит о большой напряженности иммунитета, Кроме того, нами проведено цитологическое исследование при везикулярной и некротической форма герпетического стоматита в динамике, на 3-й день после начало лечения. В результате было установлено, что несмотря на начатое лечение, цитопатическое действие вирусы продолжалось. Это проявилось увеличением числа вирус – трансформированных клеток(фото12). При везикулярной форме оно достигло 26%, при этом появились единичные многоядерные клетки. При некротической форме процент клеток с ЦПЭ достигал 62.

Однако изменения в характере воспалительного инфильтрата говорили о мобилизации механизмов иммунитета: становилось больше лимфоцитов и нейтрофилов с признаками функциональной активности, больше фагоцитирующих нейтрофилов. Отмечалось увеличение количество эозинофилов.

результатом чего явилась более легкая форма герпетического стоматита.

Таким образом, цитограммы при везикулярной, некротической и инфильтративно-язвенной форма герпетического стоматита имеют свои особенности и отражают глубину поражения тканей СОПР. Проявления ЦПЭ под воздействиям вируса указывают на проявления действенных механизмов иммунитета.

При герпетическом стоматите обнаружена следующие проявления ЦПЭ:

1. Увеличение размера ядра
2. Мелкоглыбчатый распад ядер
3. Вакуолизация цитоплазмы
4. Некротизация клеток
5. Проявление клеток неправильной формы
6. Проявление 2 –х и многоядерных клеток

Количество клеток, подверженных цитопатическому воздействию вируса , было заметно больше при некротической форме герпетического стоматита, чем при везикулярном.

Признак, наиболее характерный для герпетической инфекции – проявление многоядерных клеток (с 2 – мя ядрами и болеефото-11) обнаруживался в 1-8% клеток. Гигантские клетки были крайне редкой находкой, размеры многоядерных клеток почти не превышали размеры поверхностных клеток.

Литература:

1. Ермолова В.Д. Морфологическая характеристика интраоссальных опухолей и опухелоподобных образований челюсти лицевой костей (цитология и гистология исследования) Диссертация кандидата медицинских наук М. 1997
2. Мезгильбаева Д.М. Бакбаев Б.Б. Особенности клинического течения ХРГС. Экспериментальная и клиническая стоматология. Алматы, 1999. стр 52-54
3. Агаджанян А.А., Быкова И.А., Галенков А.К., Черейская Н.К., Лопатина В.В., Лопырева О.Н., Акопян О.Г., Результаты
4. цитологического исследования мазков-отпечатков СОПР при заболеваниях внутренних органов. «Новости клинической цитологии России», том 2, № 3-4,1998,с 125-127.
5. Дауранов И.Г., Путилин В.С., Айсарова А.М., Жарихина Т.А., Путилина Л.А. Параметры местного и ситемного иммунитета у больных хроническими воспалительными заболевании при включении в комплекс лечения минеральных добавок и энтеросорбентов. Первый национальный конгресс «Клиническая иммунология, аллергология и иммунореабилитация» Алматы,1999, стр 105-107.
6. Мустафина Ж.Г., Абдрахимова Д.Б., Копцева В.Ю. Роль цитоморфологического исследования конъюктивального эпителия в диагностике герпесвирусных кератитов, «Новости клинической цитологии России», 2001,№3-4, стр 122-125.
7. Мезгильбаева Д. М. Герпетическая инфекция и ее осложнения. Проблемы стоматологии 2010 №1-2 (47-48) стр. 6971.
8. Мезгильбаева Д. М. И др. Комплексное лечение хронического рецидивирующего герпетического стоматита с использованием неовира. Вестник КазНМУ 2011. №4 стр.65-68.