Оценка эффективности диетотерапии у детей раннего возраста с атопическим дерматитом

Согласно современным представлениям апоптоз - это процесс, возникающий в клетке в результате внутреннего или внешнего сигнала определенной интенсивности и развивающийся по типичной для данной клетки программе *1+. В процессе апоптоза сохраняется целостность клеточных мембран и внутриклеточного содержимого, отсутствуют повреждение тканей и лейкоцитарная инфильтрация. В результате апоптоза происходит физиологическая смена клеточных поколений во всех тканях организма, в том числе и в иммунной системе, благодаря чему обеспечивается физиологическое равновесие гомеостаза *2+.

Экспериментальными работами последних лет доказано, что активация апоптоза может происходить двумя основными путями: рецептор-опосредованным, при котором индуктором апоптотических изменений выступает комплекс Fas/Fas-L и др., и митохондриальным, за счет высвобождения цитохромома С и других апоптотических белков - регуляторов митохондриальных событий *3+. При сигналинге опосредованном Fas/Fas-L в результате цепочки взаимодействия «лиганд-рецептор-адаптер- эффектор» формируются агрегаты, в которых происходит активация каспазы-8 *4+. При высвобождении цитохромома С, белка Apaf-1 и митохондриальных белков активируется каспаза- 9. В дальнейшем каспазы -8 и -9 воздействуют на эффекторные каспазы -3, -6 и -7, что приводит к протеолитическому расщеплению белков клетки *5+. Таким образом, каспаза-8 выступает маркером инициации эффекторного звена апоптоза при рецепторном сигналинге, а каспаза-9 - при митохондриальном *6+. Следует отметить, что рецепторный и митохондриальный пути взаимодействуют и взаимно регулируются *7+. Поэтому в настоящее время процессы апоптоза оцениваются по белкам в зависимости от их преимущественного участия либо во внешнем (рецепторном), либо во внутреннем (митохондральном) пути активации *8+.

Доказано, что помимо CD12øа, CD95, TRAIL-R1, TRAIL-R2 тригерром апоптоза может выступать белок CD153, также являющийся представителем суперсемейства TNF, и экспрессирующийся преимущественно на активированных Т- , В- клетках и моноцитах *9+. Его растворимая форма (sCD153) c высоким аффинитетом связывается с рецептором CD30, находящимся на клеточной мембране, однако конкретные механизмы приводящие к программируемой клеточной гибели с участием данного рецептора до настоящего времени остаются малоизученными.

В настоящее время установлено, что биологическая роль аннексина-5 при апоптозе неоднозначна. Экспериментальными работами показано, что аннексин-5 попадает во внеклеточное пространство в результате гибели клеток, при этом отсутствует спецефичность его вотношении апоптоза. В терминальных стадиях апоптоза он связывается с белковыми структурами на внешней стороне плазматической мембраны, ингибируя провоспалительную активность клеток, что проявляется повышенными концентрации этого показателя в сыворотке крови *10+.

Внедрение в клиническую практику новых методов исследования позволило установить участие апоптоза в патогенезе различных заболеваний *11+. Изучение апоптоза иммунокомпетентных клеток в патогенезе аллергических болезней проводилось с целью определения особенностей его функционирования в реализации аллергического воспаления. В работах последних лет выявлена устойчивость Т-лимфоцитов к апопотозу как в фазе инициации, так и в эффекторной стадии у детей с атопической бронхиальной астмой *12+. Однако, эти данные носят фрагментарный характер, подобные исследования у детей раннего возраста при других видах аллергопатологии не проводились. Тем не менее в экспериментальных работах было установлено, что элиминация аллергенспецифических эффекторных CD8+ T-клеток за счет апоптоза не приводила к развитию аллергического воспаления кожи *13+ Поэтому раскрытие роли апоптоза в механизмах реализации аллергического воспаления представляется важным для профилактики и эффективной терапии, в том числе и диетотерапии у детей раннего возраста с АтД.

Цель работы: оценить динамику растворимых маркеров апоптоза при диетотерапии у детей раннего возраста с атопическим дерматитом.

Материалы и методы: в соответствие с целью и задачами работы проведено исследование растворимых маркеров апоптоза у 66 больных раннего возраста с АтД находившихся на искусственном вскармливании. Возраст обследованных детей был от 1,5 до 12 месяцев. Дети от 1,5 до 6 месяцев составили 35 человек (53%) от общего числа детей, дети от 1 до12 месяцев - 31 ребенок (47%). В группе детей от 1,5 до 6 месяцев преобладали мальчики 71,5 % (25 детей). Среди детей от полугода до года 53,3 % составили девочки (16 детей) и 46,7 % мальчики (22 детей). Диагноз атопический дерматит ставился на основании совокупности диагностических критериев, сформулированных на международных согласительных документах *14+. Для оценки степени тяжести атопического дерматита использовалась шкала SCORAD (Severity Scoring of Atopic Dermatitis) *15+. Аллергологическое исследование вклоючало количественное определение аллергенспецифических IgE и IgG антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) к белку коровьего молока (БКМ), казеину, ɑ-лактальбумину (ɑ-ЛА), ß-лактглобулину (ß-ЛГ) и белку козьего молока в сыворотке крови. Применялись коммерческие тест-системы Allergopharma (Германия).

Содержание sCD153, каспазы-8, sFas-L, каспазы-9 выявлялось с помощью коммерческих наборов для ИФА Bender MedSystems (Австрия), уровень аннексина-5 с помощью коммерческих наборов Biosource (BioSource International Inc, Бельгия). Изучение концентраций sFas-L и sCD153 позволяло охарактеризовать рецепторный путь апоптоза, а каспазы -8 и -9 его эффекторное звено. Определение участия аннексина-5 в реакциях апоптоза было обусловлено его регуляторной ролью. Фчет и регистрация результатов проводилась на вертикальном спектрофотометре Sunrise (TECAN, Австрия) с прилагаемым программным обеспечением. Для получения референсных значений растворимых маркеров апоптоза были использованы образцы крови детей в возрасте от 1.5 мес. до 3-х лет проходивших обследование перед малыми хирургическими операциями (грыжи и т.д.). Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом. Обработка результатов проводилась с использованием пакета статистических программ SPSS (США) для персонального компьютера. В связи с тем, что центральные тенденции и дисперсии имели нормальное распределение, при анализе определяли средние значения признака (M), стандартные ошибки среднего (m), среднеквадратичные отклонения (σ). Достоверность различий оценивалась с помощью критерия Стьюдента (t) для независимых и связанных выборок при значениях вероятности р < 0,05. Различия групп расценивались, как статистически значимые при р < 0,05 или высоко значимые при р < 0,01.

Дизайн исследования: Исследование являлось открытым, проспективным. Объектом исследования были дети раннего возраста страдающие АтД, жители московского региона. Критериями включения в исследование являлись: возраст больного (1 - 12 мес.), нахождение на искусственном вскармливании; критериями исключения - участие в другом исследовании, декомпенсированная органная патология, наличие иного аллергического заболевания, желание родителей пациента. Всем пациентам включенным в исследование после объективного обследования, проводимого для уточнения диагноза и оценки степени тяжести, исследовались аллергенспецифические IgE и IgG антитела в сыворотке крови к БКМ, казеину, ɑ-ЛА, ß-ЛГ и белку козьего молока с целью выявления причинно-значимого аллергена. Для определения sCD153, каспазы-8, sFas-L, каспазы-9 и аннексина-5 аликвоты этих сывороток были заморожены (минус 20‘С) до момента проведения анализа Диетотерапия обследованным детям назначалась с учетом данных аллергологического исследования аллергенспецифических IgE и IgG антител к белку БКМ) казеину, ɑ-ЛА, ß-ЛГ и белку козьего молока. На фоне диетотерапии детям проводилась медикаментозная терапия блокаторами Н-1 гистаминовых рецепторов и наружная кожная терапия. По результатам аллергологического обследования были сформированы группы наблюдения: в первую группу вошли дети, которые имели сенсибилизацию к белку коровьего и козьего молока (n=27) , а во вторую - дети, у которых не выявлялась сенсибилизация к белку козьего молока (n=39). Детям первой группы в качестве диетотерапии назначались смеси на основе гидролизатов коровьего молока, детям второй группы - смеси на основе козьего молока. Повторное наблюдение проводилось на 21 день диетотерапии и включало аналогичный комплекс иммунологических исследований.

Результаты и обсуждение: Было установлено, что у всех обследованных детей реализация атопического дерматита была обусловлена высокой степенью сенсибилизации к БКМ и его фракциям - казеину, ɑ-ЛА, ß-ЛГ. Частота изолированного IgE ответа составляла 52% (34 ребенка), а смешанного (IgG и IgE) - 48% (32 ребенка). Изолированный IgG ответ не выявлялся ни в одном случае наблюдения.

В проведенном исследовании об особенностях функционирования апоптоза судили по уровням sFas-L, sCD153, каспаза-8, каспаза-9 и аннексина-5 в сыворотке крови. Использованные показатели позволили создать представление, как о процессах сигналинга, так и эффекторных механизмах апоптоза с учетом степени тяжести АтД у детей (таблица № 1). Ф детей с легким течением АтД была выявлена лишь тенденция к повышению sFas-L, в то время, как концентрации sCD153 превышали значения контрольной группы при легкой, средней и тяжелой степени АтД (p<0.05). Можно предположить, что процессы сигналинга апоптоза у детей с АтД при реализации аллергического воспаления активированы. При тяжелом течении АтД показатели sFas-L и sCD153 были максимально повышены по сравнению с данными контрольной группы (p<0.05). Иная тенденция прослеживалась при изучении каспазы-8, каспазы-9 и аннексина-5. Концентрации каспаз-8, -9 у обследованных детей были статистически значимо ниже (р<0,05), чем в контрольной группе. Минимальные значения этих показателей были зарегистрированы при тяжелом течении атопического дерматита. Фчитывая в целом неспецифическую регулирующую роль каспаз в поддержке функционального равновесия, выявляемый дефицит в содержании каспаз -8 и -9, свидетельствует о дисфункции эффекторного звена апоптоза.

Отмечено статистически значимое (р<0,05), снижение концентрации аннексина-5 у детей с АтД по сравнению с контрольной группой. Фчитывая его способность к ингибированию провоспалительной активности клетки можно предположить деполяризацию иммунного равновесия в сторону аллергического воспаления.

Следовательно процессы апоптоза при развитии АтД имеют свои особенности. С одной стороны активация сигнальных систем значительно повышена, а с другой имеются косвенные признаки недостаточной элиминации измененных клеток, что способствует прогрессированию и хронизации аллергического воспалительного процесса.

Оценивая динамику исследованных показателей у детей с АтД при проведении диетотерапии отмечено статистически достоверное (p < 0.01) повышение уровня каспазы-9 в обеих группах ( таблица №2). Фровень каспазы-8 повышался только в группе детей использовавших смеси на основе козьего молока (p < 0.05). Статистически значимых различий содержания sFas-L, sCD153 и аннексина-5 на фоне диетотерапии выявлено не было, хотя имелась тенденция к нормализации исследуемых показателей. Таким образом элиминация причинно значимого аллергена у детей с АтД при проведении диетотерапии приводила к активации митохондриального пути апоптоза. Фчитывая тот факт, что при диетотерапии с использованием смесей на основе козьего молока, как одного из видов диетического продукта происходит увеличение содержания, как каспазы-9, так и каспазы-8, можно предположить, что данный вид гипоаллергенной диеты способствует более физиологичному восстановлению эффекторного звена апоптоза. Обобщая результаты проведенных исследований можно заключить, что изучение маркеров апоптоза важно с точки зрения раскрытия иммунопатогенеза АтД и определения их прогностической значимости в процессе проведении диетотерапии у детей раннего возраста.

Таблица 1 - Маркеры апоптоза в сыворотке крови детей с атопическим дерматитом (нг/мл, M±m)

* p<0.05 по сравнению с контролем

Таблица 2 - Содержание sFas-L, sCD153, каспазы-9, каспазы -8 и аннексина-5 в сыворотке крови у детей раннего возраста с АтД в процессе проведения диетотерапии (нг/мл, M±m)

*p < 0.05, и **p < 0.01 по сравнению с показателем до лечения

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Susan Elmore. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death.Toxicol Pathol. 2007. - v.35(4). - P.495-516.
2. Ream R.M., Sun J., Braciale T.J. Stimulation of naive CD8+T cells by a variant viral epitope induces activation and enhanced apoptosis .J. Immunol.2010. - v.1,184(5). - P.2401-2409
3. A Eisenberg-Lerner, S Bialik, H-U Simon. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them.Cell Death and Differentiation.2009. - v.16. - P.966-975
4. Janni T.S., Gobejishvili L., Hote.P.T., Inhibition of methionin adenosyltransferase II induces FasL expression? Fas-DISC formation and caspase -8- dependent apoptopic death in T leukemic cells.Cel/res.2009. - v.19(3). - P.358-369
5. Kroemer G., Galluzzi L.,Vandenabeele P. Cell Death classificaition of cell death: recommendations of the Nomenclature Commmittee on Cell Death.Cell Death and Differntiation.2009. - v.16. - P.3-11.
6. Kroemer G, Galluzzi L, Brenner C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.Physiol Rev.2007. - v. 87(1). - P.99-163.
7. Wilson N.S., Dixit V., Ashkenazi A. Death receptor signal transducers: nodes of coordination in immune signalimg networks.Nat. Immunol.2009.v.10. - P.348-335.
8. Kurokawa M., Kornbluth S.Caspase and kinases in a death grip.Cell.2009. - v.4,138 (5). - P.838-854.
9. Manzo F., Nebbioso A., Miceli M., et al.TNF - relativ apaptosis-inducing ligand: signaling of a ‘smart' molecule. Int.J.Biol.2009. - v.41(3). - P.460466.
10. Петрищев Н.Н., Васина Л.В., Луговая А.В. Содержание растворимых маркёров апоптоза и циркулирующих аннексин v-связанных апоптических клеток в крови больных острым коронарным синдромом. Вестн. - СПб.: Ф-та. 2008. - т.11(1). - C.14-23.
11. A Eisenberg-Lerner, S Bialik, H-U Simon. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation.2009. - v.16. - P.966-975
12. Булгакова В.А. Научное обснование и эффективность иммунопрофилактики и иммунотерапии вирусной и бактериальной инфекции у детей с бронхиальной астмой. Автореферат на соиск. уч. степени докт. мед. наук. - М.: 2009.
13. Luckey Ulrike; Maurer Marcus; Schmidt Talkea; et al. T cell killing by tolerogenic dendritic cells protects mice from allergy. Journal of clinical investigation. - 2011. - v.121(10). - P.3860-3871.
14. Carsten Flohr. Atopic Dermatitis Diagnostic Criteria and Outcome Measures for Clinical Trials: Still a Mess. Journal of Investigative Dermatology. 2011. - v.131. - P.557-559.
15. Kunz B., Oranje A.P.,Labreze L., et al. Clinical validation and guidelines for the SCORAD index: consensus report of the European Task Force on atopic dermatitis. Dermatology. - 1997. - v.195. - P.10-19.