Получение конструкций, обеспечивающих контролируемое усиление генов в трансгенных растениях

Компьютерный анализ показал, что мРНК стрессовых белков (в условиях гипертермии или гипоксии) таких как белки теплового шока (HSP) или ген алкогольдегидрогеназы (Adh),  транслируются намного эффективнее, чем при обычных физиологических условиях. Этим они обязаны энхансерным участкам, входящим в состав их лидерных последовательностей /1/. В дополнение к этому, экспрессия генов активируется только при стрессовых условиях в виду наличия регуляторных областей в участке промотора (HSEилиARE) /2, 3/. Учитывая эти особенности конструкций в настоящее время, все больше расширяется поле их практического применения.  Одним из направлений является получение трансгенных растений с встроенными целлюлазными генами  для использования их в производстве биоэтанола.

На сегодня самым экономичным способом получения этанола из растительного сырья считается одновременный ферментативный гидролиз целлюлозы и  гемицеллюлозы с последующей ферментацией получаемых свободных сахаров до этанола. В настоящее время  все чаще предлагается  новая технология экспрессии генов целлюлазы, выделенных из чистых штаммов гриба Lentinullaedodes (более известны как грибы Shiitake), способных к переработке растительной биомассы (отходы с/х производства, таких как солома злаков, опилки и т.д.) до простых сахаров. Полученные сахара в дальнейшем используются как сырье для промышленного получения биоэтанола. Сегодня в ведущих компаниях мира  рассматриваются возможности, и проводятся эксперименты по получению трансгенных растений, способных при определенных условиях (повышенные температуры до 370С)  после скашивания и  укладки в емкости, запускать синтез ферментов (целлюлаз). В результате работы встроенных генов, ферменты расщепляют целлюлозу до свободных сахаров с последующим сбраживанием до этанола /4/.    

Целью настоящих исследований является создание модельных конструкций, обеспечивающих контролируемый синтез фермента целлюлазы 7А из гриба Lentinulaedodes (Shiitake).

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования послужили синтетические трансляционные энхансеры, минимальный 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты, элемент теплового шока, репортерный ген β-глюкурунидазы (GUS) и ген фермента целлюлазы 7А из гриба Lentinulaedodes. Конструкции, были созданы путем вставки в плазмиду pCAMBIA 2300 кассеты, содержащей элемент теплового шока из плазмиды pSGH2 и минимального 35S-промотора (-60) вируса мозаики цветной капусты по сайтам рестрикции HindIIIи NcoI. Так же по сайтам рестрикции NdeI и EcoRI в плазмиду был добавлен терминатор нопалин синтазы (NOS-terminator), ответственный за сигнал полиаденилирования.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Большое внимание в течении 30 последних лет уделено изучению потенциала термофильных бактерий типаClostridium thermocellum и Clostridium thermosaccharoliticum, которые продуцируют свои активные целлюллазы и гемицеллюлозы для переработки целлюлозы при высоких до 600С температурах. Однако целлюлазные системы этих бактерий имеют достаточно сложный механизм  ферментации и поэтому в настоящее время говорить об использовании этих систем в промышленном производстве биоэтанола преждевременно. Наиболее отработанными сегодня являются системы (конструкции) переработки целлюлозы, в которых используются гены целлюлолитических ферментов, выделенные из грибов в основном из штамма грибов Lentinulla edodes (Shiitake) и  Trichoderma reesei /4/.

К настоящему времени установлено, что фермент, известный как “cellulase” действительно является комплексом ферментов (целлюлозная  ферментная система), в который входит три  основных компонента  для переработки нативной целлюлозы.

  • Эндоглюканазы (endo-ß-glucanase (EC 3.2.1.4) – случайные (не целевые) действия на растворимые и полисахаридные цепи.
  • Экзоглюканазы (exo-ß-glucanase (EC 3.2.1.91) - включают целлобиогидролазы (cellobiohydrolases), которые отщепляют целлобиозу или глюкозу от концов целлюлозной цепочки.
  • Β-глюкозидазы - (ß-glucosidase (EC 3.2.1.21), которые освобождают D-глюкозу от димеров целлобиозы и экзоглюкозидазы (exoglucosidases), которые предпочтительно гидролизируют растворимые целлодекстрины.

Как показала практика, одна из  активных   целлюлозных   ферментных систем  содержится в штаммах гриба  Lentinulla edodes (Shiitake). Это  экономически важная группа грибов, которая издана  используется в пище и в медицине. Традиционно грибы выращивают на свежих обрезках древесины. Грибы использует в качестве питательных веществ целлюлозу и гемицеллюлозу, извлекая их из гниющей древесины. Таким образом, разнообразие ферментов, продуцируемых грибами, может быть успешно использовано для переработки биомассы  с последующим получением биоэтанола. На сегодня уже клонированы 2 целлюлазных гена из штамма этого гриба (cel 7A иcel 6B). Описана экспрессия этих генов для различных источников углерода и продемонстрировано, что оба гена  активизируются в присутствии кристаллической целлюлозы /4/. 

Для обеспечения контролируемого синтеза нам необходим был минимальный 35S-промотор, который сам по себе не может обеспечивать экспрессию гена, перед которым он находится. Для экспрессии ему необходим некий помощник (helper). В качестве такого помощника нами был выбрана кассета плазмиды pSGH2, содержащая восьмикратный бинаправленный повтор области промотора теплового шока (HSE). По обеим сторонам этого элемента находится ТАТА боксы, перед элементом «HSE» находится промоторы T7 и Sp6 /3/. В данную кассету по сайтам рестрикции ферментов BamHI и SalI был клонирован минимальный 35S-промотор.

В связи с этим в наших экспериментах были созданы следующие конструкции:

Первая конструкция, (контроль) - HSE-35Smin-GUS-NOS-pCAMBIA, не содержащая никаких трансляционных энхансерных последовательностей, была получена путем вставки в пустую плазмиду pCAMBIA, кассеты с элементом теплового шока и минимального 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты, репортерного гена, кодирующего фермент β-глюкуронидазу (GUS) и терминатор нопалин синтазы (NOS-terminator), ответственного за сигнал полиаденилирования (элемент мРНК растений, защищающий от рибонуклеаз и проявляющий некий энхансерный эффект /5/).

Вторая конструкция - HSE-35Smin-115х3-GUS-TMV-NOS-pCAMBIA была ранее получена с помощью вставки в плазмиду pl-GUS по рестрикционным сайтам HindIII и NcoI ДНК фрагмента, который содержит трехкратный повтор 10 нуклеотидной последовательности повторяющий внутренний район 18S рРНК растений с 1115 по 1124 нуклеотид (последовательность ARC-1 /6/). Затем по сайтам рестрикции BamHIи NdeI в 3’-конец была вставлена 3’- нетранслируемую последовательность вируса табачной мозаики (TMV).   Для приближения мРНК к растительным, по сайтам NdeI и EcoRI в каcсету 115х3-GUS-TMV был добавлен терминатор нопалин синтазы (NOSterminator), ответственный за сигнал полиаденилирования /5/.

Третья конструкция - HSE-35Smin-115х3-Cell7A-TMV-NOS-pCAMBIA была получена с помощью замены репортерного гена GUS по сайтам рестрикции NcoI и Cfr9I на ген целлюлазы 7А из гриба Lentinulaedodes(рисунок 1) /4/.

А – контроль, состоящий из элемента теплового шока (HSE), минимального 35S CaMV-промотора, репортерного гена (GUS) и терминатора нопалин синтазы (NOS). Б – конструкция, отличающаяся от  контроля содержанием энхансерной последовательности (3хARC-1), В – конструкция, в которой репортерный ген GUSбыл заменен на ген фермента целлюлазы из гриба Lentinulaedodes;

 

 

Кассеты, обеспечивающие контролируемую экспрессию гена

Конструкции, различающиеся по наличию или отсутствию энхансерных последовательностей были клонированы в бинарную плазмиду pCAMBIA2300.

Проверка плазмид на наличие интересующих нас ДНК-фрагментов, осуществлялась методом рестрикции /7/.

Проверка конструкции HSE-35Smin-GUS-NOS-pCAMBIA(контроль) была проведена с методом обработки плазмиды рестриктазами HindIII и NcoI. В этом случае из данной плазмиды мы вырезали кассету, содержащую элемент теплового шока и минимальный 35S-промотор. Длина данного фрагмента примерно 550 пар оснований (п.о.). поскольку в данной плазмиде имеются два сайта рестрикции NcoI, дополнительно вырезается фрагмент длиною 3500 п.о., содержащий репортерный ген β-глюкурунидазы (GUS), терминатор нопалин синтазы (NOS-ter) и промотор нопалин синтазы (NOS-pro), ответственный за экспрессию маркерного гена (устойчивость к канамицину).

Конструкция  HSE-35Smin-115х3-GUS-TMV-NOS-pCAMBIAбыла проверена с помощью эндонуклеаз HindIII и NcoI. Данной конструкции элемент теплового шока, минимальный 35S-промотор и энхансерная последовательность объединены в один фрагмент, продукт рестрикции должен быть порядка 650 п.о. (HSE-35Smin – 550 п.о., 115x3 – 80 п.о.).

Третья конструкция  HSE-35Smin-115х3-Cell7A-TMV-NOS-pCAMBIA была обработана рестриктазами HindIII и NcoI для вырезания фрагмента HSE-35Smin-115x3. В рестрикционную смесь был добавлен фермент Cfr9I для вырезания гена целлюлазы 7А  длинною в 1571 п.о.

Результаты рестрикции были проанализированы с помощью гель-электрофореза в 1% агарозном геле (рисунок 2) /7/.

Проверка конструкций рестрикционным анализом 

Из рисунка 2 видно, что в случае контроля элемент теплового шока и минимальный 35S-промотор имеют длину в 550 п.о. В случае, где присутствует энхансерная последовательность 115х3, длина фрагмента увеличилась и составляет порядка 650 нуклеотидов. При рестрикционном анализе конструкции HSE-35Smin-115х3-Cell7A-TMV-NOS-pC длина фрагмента,  содержащий элемент теплового шока, минимальный 35S-промотор и энхансерную последовательность 115х3 составляет 650 п.о., и из плазмиды был вырезан ген целлюлазы 7А, длинною 1571 п.о.

В результате исследования были получены ДНК-конструкции, обеспечивающие высокую экспрессию гена и выход белка при помощи трансляционных энхансерных последовательностей.

 

ЛИТЕРАТУРА

  1. Маргулис Б.А., Гужова И.В. Белки стресса в эукариотической клетке. // Цитология, 2001, Т.42. №4. C. 323-342.
  2. Bailey-Serres J., Dawe R.K. Both 5’- and 3’-sequenses of Maize adh-1 mRNA are required for enhanced translation under low oxygen conditions.//Plant physiol., 1996, Vol.112. P. 685-695.
  3. Nover L., Neumann D., Sharf K-D. Heat shock and other stress response systems of plants// Results and problems in cell differentiation. 1989, Vol.16: P. 156-170.
  4. Charles C. Lee, Dominic W.S. Wong, George H. Robertson. Cloning and characterization of two cellulase genes from Lentinula edodes and Trichoderma reesei// FEMS Microbiology Letter, 2005 (2001), P.355-360.
  5. Gallie D.R. The cap and poly(A) tail function synergistically to regulate mRNA translational efficiency // Genes Devel., 1991, Vol.5. –Р.2108-2116.
  6. R. Zh. Akbergenov, S. Sh. Zhanybekova, R. V. Kryldakov, A. Zhigailov, N. S. Polimbetova, T. Hohn and B. K. Iskakov. ARC-1, a sequence element complementary to an internal 18S rRNA segment, enhances translation efficiency in plants when present in the leader or intercistronic region of mRNAs // Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 1, P. 239-247.
  7. Maniatis T. et al. Molecular cloning, Book I, 1989.
Фамилия автора: Д.А. Ережепов, К.К. Богуспаев, Б.К. Искаков, Э. Хеберле-Борс
Год: 2009
Город: Алматы
Категория: Экология
Яндекс.Метрика