Сохранение природных популяций рыб методами заводского воспроизводства предполагает исполъзоватъ в рыбоводном процессе все генетическое разнообразие производителей, однако в настоящее время рыбоводы вынуждены отбраковыватъ самок русского осетра, ооциты которых не достигли к началу весеннего рыбоводного сезона дефинитивных значений средней массы и степени поляризации. Одним из факторов, ограничивающих возможности продления рыбоводного сезона для дозревания самок с задержкой вителлогенеза, является недостаток зрелых самцов. В работе исследованы возможности продления спермиации у самцов русского осетра за счет дополнителъных инъекций глицеринового гипофизарного препарата (ГГП) или сурфагона - суперактивного аналога гонадотропин-релизинг-гормона млекопитающих. Рассмотрены дозировки препаратов и их сравнителъная эффективностъ в зависимости от температуры воды и интервалов между инъекциями. Показаны изменения гистологической структуры семенников после неоднократной стимуляции. В ходе этого процесса происходит последователъное сокращение количества спермиев в семенных каналъцах, что делает практически невозможным (или нецелесообразным) 4-е инъецирование. Методом твердофазного иммуноферментного анализа исследованы изменения уровней тестостерона и 11-кетотестостерона в сыворотке крови. Показано, что после кратковременного неболъшого подъема уровней обоих андрогенов, совпадающего с началом спермиации (12 час. после инъекции), наблюдается их резкое снижение.
Повторные инъекции ГГП или сурфагона, стимулирующие усиление или даже возобновление спермиации, не вызывают новых подъемов уровней андрогенов. Принципиалъной разницы в действии этих двух препаратов на показатели стероидных гормонов выявлено не было. Полученные данные продемонстpировали возможностъ дополнителъного инъецирования самцов русского осетра и, вероятно, других осетровых рыб, с целъю продления спермиции и максималъно полного исполъзования их репродуктивного потенциала.
Сохранение природных популяций рыб методами заводского воспроизводства предполагает использовать в рыбоводном процессе все генетическое разнообразие производителей. Для осетровых, однако, в начальный период нерестовой миграции характерна высокая степень гетерогенности по состоянию гонад [1,2,3]. Даже в пределах одной «биологической группы» - «озимого осетра летнего хода» показатели «навески» (количества ооцитов в 1 г) у одновременно выловленных самок в низовьях Волги могут варьировать в очень широких пределах - от 80 до 200 шт./г и более. К началу нерестового периода различия в состоянии репродуктивной системы сглаживаются, но полностью не исчезают, поэтому особи, поступившие на рыбоводные заводы с «навеской» более 200 шт./г, с очень высокой долей вероятности весной следующего года имеют только III-IV или IV незавершенную стадию зрелости гонад. Это вынуждает рыбоводов либо отбраковывать таких рыб, либо существенно растягивать рыбоводный процесс, перенося получение зрелой икры от них на более поздние сроки [4, 5].
Удлинение сроков работы с производителями при весьма ограниченных масштабах заготовки диких рыб и резком преобладании самок в ремонтно-маточных стадах невозможно осуществить без максимального продления спермиации у самцов, способных давать полноценную сперму. Возможности продления и усиления спермиации за счет дополнительной гормональной обработки изучались нами с начала 2000 годов [6, 7, 8]. Вместе с тем, данные по физиологическим аспектам продления спермиации за счет дополнительных инъекций весьма фрагментарны [9, 10].
В настоящей работе исследовано влияние повторных гормональных инъекций на изменения уровней андрогенов в сыворотке крови и состояние гонад у этого вида.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Сбор материала проводился на Александровском осетровом рыбоводном заводе в низовьях Волги с 2004 по 2011 г. Для первой инъекции использовали сурфагон в дозе 15 мкг на рыбу (1,5-2 мкг/кг). Повторную гормональную стимуляцию проводили только нормально созревшим после 1-й инъекции особям, вводя ГГП (от 50 до 66 Л.Е.) или 20-25 мкг сурфагона на особь.
Сбор материала для гистологической обработки (пробы ткани семенников) проводился в 2004-2007 г. (в более поздние годы самцы после получения спермы не забивались). Для фиксации в жидкости Буэна вырезали участок семенника (примерно 0,5х0,5х1 см) из центральной части железы. После фиксации материал проводили через спирты возрастающей крепости и хлороформ с последующей заливкой в парафин. Срезы толщиной 5-6 мкм окрашивались железным гематоксилином по Гейденгайну.
Для измерения концентрации стероидных гормонов был использован твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Взятие проб крови из хвостовой вены (прижизненно) проводилось в 2004 и 2011 гг.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Состояние семенников самцов осетра на IV стадии зрелости гонад показано на рис. 1. Семенные канальцы на этой стадии забиты зрелыми спермиями. Введение таким рыбам сурфагона сопровождалось спермиацией, которая начиналась примерно через 12 час. и достигала максимума через 18-24 час. после инъекции, в зависимости от температуры воды. Через 2-3 дня после инъекции спермиация существенно ослаблялась (снижались как объемы продуцируемой спермы, так и ее концентрация). Забой контрольных самцов после затухания спермиации показал, что содержание спермиев в семенных канальцах почти не изменилось (рис. 2), что создает предпосылки для дополнительной гормональной стимуляции.
Дополнительная инъекция ГШ на нижнем и среднем диапазоне нерестовых температур (до 14-14,5 °С) стимулировала спермиацию у большинства самцов при продолжительности интервала между инъекциями до 6 дней. При увеличении этого интервала до 10 сут. эффективность второй инъекции существенно снижалась. Действие сурфагона при повторной инъекции либо оказывалось аналогичным введению ГГП (при относительно небольших интервалах между инъекциями - 3-4 дня и температуре воды до 13-13,5°С), либо уступало по эффективности введению ГГП (особенно во второй половине рыбоводного сезона и больших интервалах между инъекциями). Третья гормональная стимуляция в большинстве случаев вызывала освобождение спермы у весьма ограниченного числа самцов, особенно при больших интервалах между 1-2-й или 2-3-й инъекциями. Сурфагон при 3-й инъекции явно уступал ГГП по своей эффективности.
Содержание спермиев в семенных канальцах последовательно снижалось после каждой инъекции, в результате уже после 3-й инъекции в семенниках наблюдалось значительное истощение запасов спермы (рис. 3), что исключало возможность 4-го инъецирования. Другим вариантом прекращения спермиации следует считать процесс резорбции спермиев (рис. 4), который делает невозможным ответы на дополнительные инъекции как сурфагона, так и ГГП.
Для всех самцов осетра на IV стадии зрелости гонад характерно высокое содержание тестостерона и 11-кетотестостерона в сыворотке крови. После однократной инъекции сурфагона обычно наблюдаются кратковременные пики андрогенов [11], следы которых мы зарегистрировали через 12 час. после инъекции (рис. 5 и 6).
С момента начала спермиации уровни обоих андрогенов последовательно снижались, почти достигая нижнего предела измерений через 7 дн. после инъекции. 2-я и 3-я инъекция (введение ГГП) не приводили к подъему уровней тестостерона и 11-кетотестостерона. Использование при 2-й инъекции сурфагона вместо ГГП не меняло профилей стероидных гормонов - мы не отмечали какого-либо подъема андрогенов после гормональной инъекции (рис. 7 и 8). Таким образом, усиление спермиации под влиянием дополнительных инъекции (независимо от природы вводимого препарата) проходило на фоне очень низких значений концентрации обоих андрогенов в сыворотке крови, совершенно нетипичных для зрелых самцов этого вида.
Полученные результаты показали возможность дополнительного инъецирования самцов русского осетра как ГГП, так и сурфагоном. При интервалах между инъекциями от 3 до 5 дней, общая продолжительность периода, в течение которого может быть получена рыбоводная сперма от какой-то партии самцов, может составлять до 8-12 дней. С учетом возможности хранения на льду собранной спермы в полиэтиленовых мешках, заполненных кислородом [12], этот срок вполне может быть продлен примерно до 2-2,5 недель, что позволяет проводить дополнительное выдерживание до перехода в преднерестное состояние самок осетра с небольшими задержками вителлогенеза.
Кроме того, данный метод позволяет более экономно использовать репродуктивный потенциал заготовленных самцов, это дает возможность резервировать какую-то часть производителей (при температурах воды ниже нерестовых) для оплодотворения икры тех самок, которым для перехода в преднерестное состояние потребуется больший срок дополнительного выдерживания, чем 2,5 недели.
ЛИТЕРАТУРА
- Гербильский FL Л. Биологические группы куринского осетра (Acipenser gueldenstaedti persicus Borodin) и основание для их заводского воспроизводства // Докл. АН СССР. - 1950. - Т. 71. - № 4. - C. 785-788.
- Баранникова И.А. Биологическая дифференциация стада каспийского осетра (в связи с задачами промышленного осетроводства в дельте Волги) // Ученые записки ЛГУ. 1957.- № 228. - Вып. 44.- C. 54-71.
- Баранникова И.А. Функциональные основы миграций. Л.: Наука. Ленингр. Отд. - 1975. - 210. с.
- Тренклер И.В. Асинхронность созревания самок волго-каспийского осетра в условиях рыбоводного завода. В кн.: «Научные основы сельскохозяйственного рыбоводства: состояние и перспективы развития», M.: ВНИИР. - 2010.- С. 398-404.
- Тренклер И.В., Рудометкин Л.Ф. Применение экспресс-анализа состояния ооцитов при ранних сроках получения зрелых половых клеток русского осетра на рыбоводных заводах // Мат. IV Междунар. Науч.-практ. Конф. «Проблемы сохранения экосистемы Каспия в условиях освоения нефтегазовых месторождений». Астрахань. - 2011. - С. 239-243.
- Груслова А.Б., Тренклер И.В.. Возможности повторного использования самцов русского осетра (Acipenser gueldenstaedti Br.) для рыбоводных целей //Мат. 2-й Международ. научно-практич. конф. «Аквакультура осетровых рыб: достижения и перспективы развития». Астрахань. 21-22 ноября 2001.- С. 22-23.
- Тренклер И.В. Возможности усиления и продления спермиации у самцов русского осетра за счет дополнительной инъекции сурфагона // Доклады Международной научно-практической конференции «Развитие аквакультуры в регионах:проблемы и возможности». 10-11 ноября 2011 г., М. ВНИИР.- С. 186-194.
- Тренклер И.В., Груслова А.Б. Возможности получения спермы высокого качества от самцов осетра и белуги озимых и яровых форм // Мат. Докладов IV Международ. Науч.-практ. конф. «Аквакультура осетровых рыб: достижения и перспективы развития». Астрахань, март 2006.- С. 127-130.
- Груслова А.Б., Тренклер И.В. Влияние повторной гормональной стимуляции на уровни кортизола и тестостерона в сыворотке крови самцов русского осетра (Acipenser gueldenstaedti Br.) //Мат. Международ. конф. «Современные проблемы Каспия». Астрахань. ноябрь 2002. - С. 87-89.
- Тренклер И.В., Груслова А.Б., Мочарук О.Г, Баюнова Л.В., Семенкова Т.Б. Изменения гонадотропной активности гипофиза и уровней половых стероидов в сыворотке крови у самцов русского осетра после дополнительных инъекций гипофизарного препарата или аналога ЛГ-РГ // Тезисы VIII Всероссийской конференции "Нейроэндокринология-2010", Санкт-Петербург: "Олимп-СПб", 2010.- С. 137-139.
- Semenkova T.B., Barannikova I.A., Kime D.E., McAllister B.G., Bayunova L.V., Dyubin V.P. and Kolmakov N. Sex steroids profiles in female and male stellate sturgeon (Acipenser stellatus Pallas) during final maturation induced by hormonal treatment // J. Appl. Ichtiol. 2002. V. 18. - Р. 375381.
- Методические рекомендации для стимуляции созревания самок и самцов осетровых рыб на рыбоводных заводах дельты Волги (сост. И.В. Тренклером)// Санкт-Петербург, ФГУ Севзапрыбвод: «НІиК». - 2010. - 44 с.