Другие статьи

Цель нашей работы - изучение аминокислотного и минерального состава травы чертополоха поникшего
2010

Слово «этика» произошло от греческого «ethos», что в переводе означает обычай, нрав. Нравы и обычаи наших предков и составляли их нравственность, общепринятые нормы поведения.
2010

Артериальная гипертензия (АГ) является важнейшей медико-социальной проблемой. У 30% взрослого населения развитых стран мира определяется повышенный уровень артериального давления (АД) и у 12-15 % - наблюдается стойкая артериальная гипертензия
2010

Целью нашего исследования явилось определение эффективности применения препарата «Гинолакт» для лечения ВД у беременных.
2010

Целью нашего исследования явилось изучение эффективности и безопасности препарата лазолван 30мг у амбулаторных больных с ХОБЛ.
2010

Деформирующий остеоартроз (ДОА) в настоящее время является наиболее распространенным дегенеративно-дистрофическим заболеванием суставов, которым страдают не менее 20% населения земного шара.
2010

Целью работы явилась оценка анальгетической эффективности препарата Кетанов (кеторолак трометамин), у хирургических больных в послеоперационном периоде и возможности уменьшения использования наркотических анальгетиков.
2010

Для более объективного подтверждения мембранно-стабилизирующего влияния карбамезапина и ламиктала нами оценивались перекисная и механическая стойкости эритроцитов у больных эпилепсией
2010

Нами было проведено клинико-нейропсихологическое обследование 250 больных с ХИСФ (работающих в фосфорном производстве Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции)
2010


C использованием разработанных алгоритмов и моделей был произведен анализ ситуации в системе здравоохранения биогеохимической провинции. Рассчитаны интегрированные показатели здоровья
2010

Специфические особенности Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции связаны с производством фосфорных минеральных удобрений.
2010

Изучение способности молочнокислых бактерий утилизировать побочный продукт пивоваренного производства

Химическая индустрия на основе нефти выпускает гигантский ассортимент продукции, в том числе и бытового назначения. В частности, невозобновляемые запасы нефти расходуются на произ­водство таких изделий, как пластиковая пленка, пластмассовые бутылки и пакеты, которые практиче­ски не поддаются биологическому разложению. В качестве конкурента пластику, произведенному из нефтепродуктов, выступает восстанавливаемый и биодеградируемый пластик, производимый из по-лилактата (polylactic acid — PLA) — продукта конденсации молочной кислоты [1].

Основной рынок использования молочной кислоты (МК) — это пищевая, фармацевтическая и косметическая промышленность, однако в связи с множеством перспектив в применении полилактата ожидается значительное увеличение его потребления. Так, в 2008 г. производственный объем соста­вил 260 тыс. тонн 100 %-ной молочной кислоты для традиционного рынка использования (включая PLA), в 2010 г. сделан прогноз на более чем 1 млн тонн его ежегодного производства [2].

В большинстве случаев для производства полимолочной кислоты (PLA) более пригоден L(+)-изомер молочной кислоты (L-МК), более чем 95 % промышленного производства которой основыва­ется на процессе микробной ферментации. Молочнокислые бактерии имеют преимущества в целях селективного получения D(-)- и L(+)-изомеров МК из-за их высокой кислотоустойчивости и возмож­ности проведения генетических манипуляций, но обладают такой отрицательной чертой, как требо­вание богатой питательной среды, что усложняет получение кислоты при неполной или незначитель­ной утилизации пентоз [3].

Для уменьшения затрат, связанных с производством молочной кислоты, разработан штамм Escherichia coli SZ85, продуцирующий L-МК на минеральной среде и имеющий замену части коди­рующего хромосомального участка ldhA на ген ldhL, кодирующий L-лактат дегидрогеназу [4, 5]. Кроме молочнокислых бактерий для промышленного производства лактата используются и другие бактерии (Bacillus coagulans), а также мицелиальные грибы (Rhizopus spp.), метаболически реконст­руированные дрожжи и цианобактерии [6, 7].

На себестоимость производства молочной кислоты в значительной степени влияет стоимость сырого продукта. Для биологического производства молочной кислоты дорогостоящим является ис­пользование моносахаров, таких как глюкозы, сахарозы и т.д., хотя это обеспечивает ее высокую чис­тоту. Использование же отходов и вторичных ресурсов перерабатывающих отраслей промышленно­сти позволяет удешевить производство молочной кислоты в сравнении с определенными сахарами.

При ферментации на питательной среде, содержащей молочную сыворотку, высокопродуктив­ный продуцент L(+)-молочной кислоты штамм Enterococcus faecium В-2240 D позволяет получать целевой продукт с весьма низкой себестоимостью, выходом до 95 % и оптической чистотой до 99,8 % [8]. Известно, что использование кокковых форм молочнокислых бактерий [9-13] для производства молочной кислоты представляется предпочтительным в связи с тем, что они обладают большей ско­ростью роста, обеспечивающей, следовательно, ускорение накопления молочной кислоты в культу-ральной жидкости и сокращение производственного цикла.

В целом высокая стоимость и ограниченные запасы ископаемого топлива вызывают большой интерес к использованию восстанавливаемых источников для производства этанола, молочной кислоты и других химических веществ. Производство МК имеет огромное значение в различных отрас­лях промышленности, например, для получения биодеградируемого растворителя этиллактата, кото­рый применяется при производстве электротехники, лаков и красок, текстиля, смазок, клеев и т.д. Производные молочной кислоты являются нетоксичными и не оказывают негативного влияния на окружающую среду в сравнении с нефтепродуктами. Среди европейских стран рынок молочной ки­слоты наиболее развит в Германии (29,3 % по оценкам 2008 г.), далее следуют Франция и Италия. Самый крупный производитель биоразлагаемого L-PLA — американская компания NatureWorks LLC (140 000 тонн/год) [14]. Кроме того, PLA производится компанией Toyota (Япония), Hitachi (Япония), Dupont (США), Galactic (Бельгия), Hisun Biomaterials (Китай), а основной производитель LD-поли-лактата — компания PURAC (Нидерланды) [15]. В настоящее время единственным в России пред­приятием по производству молочной кислоты (lactic acid) является ООО «Сухой крахмал и молочная кислота» (ООО «СКИМК») [16], в Республике Казахстан таких предприятий нет.

Таким образом, для обеспечения отечественного рынка молочной кислотой, используемой не только при производстве косметики, пищевых продуктов, в фармацевтической отрасли, но и в сель­скохозяйственной промышленности, актуальным и перспективным является разработка технологий получения молочной кислоты на основе возобновляемого сырья.

Цель данных исследований — изучение способности штаммов молочнокислых бактерий расти на среде, основанной на водной вытяжке побочных продуктов пищевого производства, а также опре­деление концентрации молочной кислоты, продуцируемой различными штаммами.

Объекты и методы исследований

Объектами исследования были депонированные в РГП «Республиканская коллекция микроорга­низмов» штаммы молочнокислых бактерий, а также пробы пивной дробины, любезно предоставлен­ные частной пивоварней «Пивоварофф» (г. Астана).

Оценку чистоты бактериальных штаммов осуществляли согласно методам классической микро­биологии [17, 18]. Общеизвестный метод идентификации бактерий в основном ориентирован на ис­пользовании определителя «Bergey Manual of Systematic Bacteriology» [19].

Активность кислотообразования бактериальных штаммов определяли титриметрическим мето­дом [20]. Количественное определение содержания L-молочной кислоты проведено с использованием коммерческого набора фирмы Абкам (США) и спектрофотометра фирмы Биорад (США).

Для выделения ДНК бактериальных культур использован коммерчески доступный набор Wizard Genomic DNA Purification Kit 500 (Promega, USA). Выделение ДНК, агарозный гель-электрофорез, ПЦР-метод выполнены согласно общеизвестным методам [21]. Для определения нуклеотидной по­следовательности гена 16S rDNA проводили ПЦР с использованием праймеров 8f (5-AGAGT-TTGATCCTGGCTCAG-3') и 806r (5'-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3'), которые являются универ­сальными для бактерий.

В целях получения достоверных данных все эксперименты проводили в 2-4-кратной повторно-сти, результаты обрабатывались общепринятыми статистическими методами [22].

Результаты исследований

Проведен отбор штаммов, относящихся к различным видам молочнокислых бактерий, и изучена их способность расти на среде, основа которой состоит из побочного продукта пивоваренного произ­водства, в частности, из водной вытяжки зерновой дробины. Так, в таблице представлены результаты изменения количества КОЕ (колониеобразующих единиц) штаммов молочнокислых бактерий при их культивировании на среде с побочными продуктами пивного производства. При этом для определе­ния оптимальных условий роста молочнокислых бактерий на водной вытяжке зерноотхода была ис­пользована среда с двукратно разведенным экстрактом (50 %) и без разведения (100 %). Учитывая, что исходная вытяжка пивной дробины содержит незначительное количество (до 0,115 %) восстанав­ливающих сахаров, то дополнительно в среду добавлен 1 % глюкозы. Установлено, что штаммы мо­лочнокислых бактерий хорошо растут на среде с водной вытяжкой зерноотходов, причем титр клеток бактерий был выше в два и более раза при использовании неразведенной 100 %-ной вытяжки побоч­ного продукта.

Определение титра клеток молочнокислых бактерий при культивировании на среде с побочными продуктами

Как известно, активное кислотообразование бактерий рассматривается как один из важных фак­торов их антагонизма в отношении других видов микроорганизмов. Поэтому наиболее известным биологическим свойством молочнокислых бактерий, в том числе лактобацилл, является их способ­ность продуцировать молочную кислоту.

При изучении кислотообразующей активности по методу Тернера молочнокислые бактерии условно подразделяют на три группы: 1 группа — с низкой кислотообразующей активностью до 40 °Т (градусов по Тернеру), 2 группа — со средней кислотообразующей активностью 40-79 °Т, 3 группа — с высокой активностью — от 80 °Т и выше [17, 18]. Результаты определения титруемой кислотности у исследуемых молочнокислых бактерий показали, что все исследуемые штаммы мо­лочнокислых бактерий обладают высокой кислотообразующей активностью и уровень кислотообра-зования был в пределах 130-270 °Т.

В связи с тем, что метод Тернера позволяет определять накопление не только молочной кислоты в среде, но и других органических кислот, продуцируемых бактериями, проведено количественное определение молочной кислоты с помощью коммерчески доступного набора фирмы Абкам (США). Для определения уровня содержания молочной кислоты был построен калибровочный график (рис. 1) с использованием стандарта молочной кислоты фирмы Абкам (США).

Калибровочная кривая определения концентрации молочной кислоты

После двухсуточного культивирования исследуемых штаммов молочнокислых бактерий на MRS бульоне проведено определение концентрации молочной кислоты в культуральной жидкости соглас­но протоколу фирмы-производителя Абкам.

На рисунке 2 показано изменение показателя оптической плотности реакционной смеси с добав­лением супернатанта, полученного с различными культурами молочнокислых бактерий. При пере­расчете в соответствии с калибровочной кривой установлено, что штаммы 0008 RKM, 0016 RKM, 0021 RKM и 0025 RKM способны продуцировать L-молочную кислоту в концентрации 10 и более наномоль/лунку, в сравнении со штаммами 0012 RKM, 0014 RKM, 0015 RKM, 0023 RKM и 0024 RKM. При этом контрольный вариант неинокулированной питательной среды (К) показал незначи­ тельное изменение уровня адсорбции, что обусловлено бэкграундом самой питательной среды. По­этому согласно инструкции фирмы-производителя данного колориметрического набора (Абкам, США) проведен вычет показаний контрольного варианта. В результате проведенных расчетов выяв­лена способность штаммов 0008 RKM, 0016 RKM, 0021 RKM продуцировать L-молочную кислоту в концентрации 4,7-5,0 мМ, тогда как высокую активность показал штамм 0025 RKM (5,5 мМ). У ос­тальных исследованных штаммов молочнокислых бактерий выход молочной кислоты был в пределах от 4,3 до 4,6 мМ, а штамм 0024 RKM характеризовался низкой продуцирующей активностью с выхо­дом молочной кислоты 2,5 мМ на литр питательной среды, что обусловлено слабым ростом данной культуры на жидкой питательной среде MRS.

Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S rDNA исследуемых штаммов молочнокислых бактерий показал 99-100 %-ную идентичность с нуклеотидными последовательностями штаммов, относящихся к роду Lactobacillus spp., депонированными в международной базе данных GenBank.

Таким образом, в данной серии экспериментов установлено, что различные штаммы молочно­кислых бактерий, являющихся известными продуцентами молочной кислоты, могут утилизировать отходы пивоваренного производства. Дальнейшая оптимизация условий культивирования позволит повысить активность исследуемых штаммов-продуцентов, способных вырабатывать молочную ки­слоту в пределах 2,5-5,5 мМ на стандартной питательной среде MRS. Как известно, использование органических отходов, повсеместно образующихся в пищевой и перерабатывающей промышленно­сти Казахстана, позволит не только обеспечить удаление источников загрязнения окружающей сре­ды, но и обусловит превращение этих отходов в полезные целевые продукты, в частности для полу­чения молочной кислоты.

 

 

Список литературы

  1. Abdel-Rahmana M.A., Tashiroc Y., Sonomoto K. Lactic acid production from lignocellulose-derived sugars using lactic acid bacteria: Overview and limits // Journal of Biotechnology. — 2011. — 156. — P. 286- 301.
  2. Taskila S., Ojamo H. The current status and future expectations in industrial production of lactic acid by lactic acid bacteria // Lactic acid bacteria — R & D for food, health and livestock purposes / Ed. by M.Kongo. — Rijeka, Croatia: InTech, —615-632.
  3. de Vos W.M. Systems solutions by lactic acid bacteria: from paradigms to practice // Microb. Cell Fact. — 2011. — 10, No. 1-2. — P. 1-13.
  4. Zhou S., Causey T.B., Hasona A., Shanmugam K.T., Ingram L.O. Production of Optically Pure D-Lactic Acid in Mineral Salts Medium by Metabolically Engineered Escherichia coli W3110 // Appl. and environ. microbiol. — 2003. — 69, No. 1. —399-407.
  5. Zhou S., Shanmugam K.T., Ingram L.O. Functional Replacement of the Escherichia coli D(-)-Lactate Dehydrogenase Gene (ldhA) with the L(+)-Lactate Dehydrogenase Gene (ldhL) from Pediococcus acidilactici // App. and environ. microbiol. — 2003. Vol. 69, 4. — P. 2237-2244.
  6. Patel M.A. Ou M.S., Harbrucker R., Aldrich H.C., Buszko M.L., Ingram L.O., Shanmugam K.T. Isolation and Characteriza­tion of Acid-Tolerant, Thermophilic Bacteria for Effective Fermentation of Biomass-Derived Sugars to Lactic Acid // App and en­viron. microbiology. — 2006. — Vol. 72, No. 5. — P. 3228-3235.
  7. Yang X. Lai Zh., Lai Ch., Zhu M., Li Sh., Wang J., Wang X. Efficient production of L-lactic acid by an engineered Thermoanaerobacterium aotearoense with broad substrate specificity // Biotechnology for Biofuels. — 2013. — Vol. 6, No. 124. — P. 1-12.
  8. Skory Ch.D. Isolation and Expression of Lactate Dehydrogenase Genes from Rhizopus oryzae // Applied and environm. microbiol. — 2000. — 66, No 6. — P. 2343-2348.
  9. Ilmen M., Koivuranta K., Ruohonen L., Suominen P., Penttila M. Efficient Production of L-Lactic Acid from Xylose by Pichia stipitis // Appl. and environ. microbiology. — 2007. — 73, No. 1. — P. 117-123.
  10. Varman A.M., Yu Y., You L., Tang Y.J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium // Mi­crobial Cell Factories. — 2013. — 12, No. 117. — P. 1-8.
  11. Пат. 2205216 Российская Федерация, МПК7C12N001/20 C12P007/56 C12N001/20 C12R001/01. Штамм бактерий Enterococcusfaecium в-2240d — продуцент оптически чистой L(+)-молочной кислоты и промышленный способ получения L(+)-молочной кислоты или ее солей / Галкина Г.В., Илларионова В.И.; заявитель и патентообладатель Морозов Василий Юрьевич. № 2000125372/13; заявл. 05.12.00; опубл. 27.05.2003, Бюл. № 3. 22 с.
  12. Carvalho A.L., Cardoso F.S., Bohn A., Neves A.R., Santos H. Engineering trehalose synthesis in Lactococcus lactis for im­proved stress tolerance // Appl. Environ. Microbiol. — 2011. — 77, No. 12. — Р. 4189-4199.
  13. Guo T., Kong J., Zhang L., Zhang C, Hu Sh. Fine Tuning of the Lactate and Diacetyl Production through Promoter Engi­neering in Lactococcus lactis // Plos one. — 2012. — Vol. 7, Issue 4. — e36296 [Электронныйресурс]
  14. Vink E.T.H., Davies S., Kolstad J.J. The eco-profile for current Ingeo polylactide production // Industrial Biotechnology. — 2010. — 6, No. 4. — P. 212-224.
  15. [ЭР]:http://www.corbion.com
  16. [ ЭР]:http://www.skimk.ru
  17. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И.Нетрусов, М.А.Егорова, Л.М.Захарчук и др.; Под ред. А.И.Нетрусова. — М.: Изд. центр «Академия», 2005. — 608
  18. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для вузов / Е.З.Теппер, В.К.Шильникова, Г.И.Переверзева; Под ред. В.К.Шильниковой. — М.: Дрофа, 2004. — 256 с.
  19. Хоулт Дж., КригН. Определитель бактерий Берджи: В 2 т. — М.: Мир, 1997. — Т. 1. — 432 с.; Т. 2. — 368 с.
  20. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Учеб. пособие / М.Н.Пименова, Н.Н.Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И.Нетрусов и др.; Под ред. Н.С.Егорова. — М.: Изд-во МГУ, 1995. — 224 с.
  21. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. —Y., 1989. — 1659 p.
  22. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов. — 4-е изд., перераб. и доп. — М.: Высш. шк., 1990. —352 с.

Разделы знаний

Архитектура

Научные статьи по Архитектуре

Биология

Научные статьи по биологии 

Военное дело

Научные статьи по военному делу

Востоковедение

Научные статьи по востоковедению

География

Научные статьи по географии

Журналистика

Научные статьи по журналистике

Инженерное дело

Научные статьи по инженерному делу

Информатика

Научные статьи по информатике

История

Научные статьи по истории, историографии, источниковедению, международным отношениям и пр.

Культурология

Научные статьи по культурологии

Литература

Литература. Литературоведение. Анализ произведений русской, казахской и зарубежной литературы. В данном разделе вы можете найти анализ рассказов Мухтара Ауэзова, описание творческой деятельности Уильяма Шекспира, анализ взглядов исследователей детского фольклора.  

Математика

Научные статьи о математике

Медицина

Научные статьи о медицине Казахстана

Международные отношения

Научные статьи посвященные международным отношениям

Педагогика

Научные статьи по педагогике, воспитанию, образованию

Политика

Научные статьи посвященные политике

Политология

Научные статьи по дисциплине Политология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Психология

В разделе "Психология" вы найдете публикации, статьи и доклады по научной и практической психологии, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. В своих работах авторы делают обзоры теорий различных психологических направлений и школ, описывают результаты исследований, приводят примеры методик и техник диагностики, а также дают свои рекомендации в различных вопросах психологии человека. Этот раздел подойдет для тех, кто интересуется последними исследованиями в области научной психологии. Здесь вы найдете материалы по психологии личности, психологии разивития, социальной и возрастной психологии и другим отраслям психологии.  

Религиоведение

Научные статьи по дисциплине Религиоведение опубликованные в Казахстанских научных журналах

Сельское хозяйство

Научные статьи по дисциплине Сельское хозяйство опубликованные в Казахстанских научных журналах

Социология

Научные статьи по дисциплине Социология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Технические науки

Научные статьи по техническим наукам опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физика

Научные статьи по дисциплине Физика опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физическая культура

Научные статьи по дисциплине Физическая культура опубликованные в Казахстанских научных журналах

Филология

Научные статьи по дисциплине Филология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Философия

Научные статьи по дисциплине Философия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Химия

Научные статьи по дисциплине Химия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Экология

Данный раздел посвящен экологии человека. Здесь вы найдете статьи и доклады об экологических проблемах в Казахстане, охране природы и защите окружающей среды, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. Авторы рассматривают такие вопросы экологии, как последствия испытаний на Чернобыльском и Семипалатинском полигонах, "зеленая экономика", экологическая безопасность продуктов питания, питьевая вода и природные ресурсы Казахстана. Раздел будет полезен тем, кто интересуется современным состоянием экологии Казахстана, а также последними разработками ученых в данном направлении науки.  

Экономика

Научные статьи по экономике, менеджменту, маркетингу, бухгалтерскому учету, аудиту, оценке недвижимости и пр.

Этнология

Научные статьи по Этнологии опубликованные в Казахстане

Юриспруденция

Раздел посвящен государству и праву, юридической науке, современным проблемам международного права, обзору действующих законов Республики Казахстан Здесь опубликованы статьи из научных журналов и сборников по следующим темам: международное право, государственное право, уголовное право, гражданское право, а также основные тенденции развития национальной правовой системы.