Разнообразие сортов и коллекционных образцов эспарцета по спектрам белков

Авторами проведен электрофорез запасных белков семян сортовой популяции эспарцета Onobrychis viciifolia (Алма-Атинский 2), коллекционных образцов эспарцета песчаного Onobrychis arenaria и закавказского Onobrychis transcaucasica. Установлено значительное разнообразие популяций по чис­лу, подвижности и интенсивности компонентов. Высокая гетерогенность сорта Алма-Атинский 2 объ­ясняется изначальной неоднородностью при передаче на сортоиспытание и длительностью возделы­вания в регионе. Отмечено, что белковые характеристики могут быть полезны как для генетических исследований культуры, так и для использования в качестве маркеров в селекции и семеноводстве сортов. 

Эспарцет (Onobrychis Mill.) является ценной кормовой культурой, насчитывающей более 130 ви­дов, распространенных во многих частях света, включая западную Азию, Европу, западную часть США и Канаду [1, 2].

В странах СНГ эспарцет представлен 62 видами, в культуре широко используются три: виколи-стный (посевной, европейский, обыкновенный) — Onobrychis viciifolia Scop., введенный в культуру около 500 лет назад, песчаный — Onobrychis arenaria Kit. D. C., впервые введенный в культуру на Украине в начале XX в., и закавказский (переднеазиатский) — Onobrychis transcaucasica (antasiatica) Khin. — самый древний вид эспарцета, имеющий более чем тысячелетнюю историю возделывания в Закавказье [3].

В отличие от других видов трав эспарцет менее требователен к почвам и при наличии влаги в ней дает высокие урожаи даже на самых бедных почвах. Культура отличается высокой зимостой­костью, засухоустойчивостью, отзывчивостью на увлажнение, высокой пластичностью и большой кормовой ценностью [4].

Зеленая масса эспарцета является хорошим в питательном отношении сырьем для сенажа и си­лоса. Так, в среднем в 100 кг зеленой массы эспарцета содержится 21,7 кормовые единицы и 3,1 кг перевариваемого протеина, в 100 кг сена — 54 кормовые единицы и 10,1 кг перевариваемого протеи­на, каротина — 2,5 г. В отличие от люцерны при скармливании в зеленом виде эспарцет не вызывает у животных тимпонита. По содержанию белка сено эспарцета уступает только сену люцерны и пре­восходит сено клевера. В сене эспарцета содержится большое количество кальция и минеральных солей, необходимых для нормального развития продуктивных животных, особенно молодняка [5].

Посевы эспарцета улучшают структуру почвы, обогащают почвы гумусом и азотом, предотвраща­ют эрозию и деградацию почв, нормализуют водный режим агроэкосистем, расширяют биоразнообра­зие агроценоза, повышают устойчивость агроэкосистем к засухам и опустыниванию территории, укре­пляют агроландшафты, улучшают экологическую обстановку и оздоравливают окружающую среду.

В Казахстане эспарцет введен в полевое кормопроизводство в 50-х годах прошлого столетия и в силу своих биологических особенностей получил значительное распространение как перспективная культура для повышения кормовой базы.

В связи с изложенным выше исследования, направленные на изучение генофонда культуры на уровне рода, вида и популяции, являются актуальными.

Белковые маркеры, в частности компоненты запасных белков, широко используются в оценке генетического разнообразия видов сельскохозяйственных растений и выявления внутрисортовой ге­терогенности и полиморфности, однако данные о внутрипопуляционной характеристике сортов вида Onobrychis viciifolia и других видов рода Onobrychis Mill. в литературе отсутствуют, сведения о меж-популяционном разнообразии незначительны.

Профиль запасных белков эспарцета анализировался для выявления межвидовой изменчивости и таксономических уточнений [6]. Авторами не выявлены четкие различия между 8 анализированными видами. На другом наборе образцов рода Onobrychis Mill., включающем 10 видов, установлены стабильные и вариабельные белковые зоны в электрофоретическом спектре, на чем обосновывается за­ключение о высоком уровне сходства между анализированными видами [7].

Целью наших исследований было изучение состава запасных белков семян сорта эспарцета Ал­ма-Атинский 2 (Onobrychis viciifolia), допущенного в производство в Алматинской области с 1980 г., а также коллекционных образцов эспарцета песчаного и закавказского и оценка степени их генетиче­ского разнообразия.

Материалы и методы исследований

Объектом исследований являлись: сорт эспарцета Алма-Атинский 2 урожая 2013 г. и коллекци­онные номера (9 — эспарцета песчаного и 8 — эспарцета закавказского), список и происхождение которых приведены в таблице.

Для подготовки белковых проб семена эспарцета отделяли от околоплодника, подсушивали и, измельчив в ступке каждое семя, помещали в отдельные эппендорф-пробирки. Экстракцию белков вели 0,0618 М трис-НО буферным раствором, содержащим 3 % ДДС Na, 10 % глицерина, 4 % мер-каптоэтанола и краситель бромфеноловый синий.

Экстракцию проводили в течение двух часов на качалке при комнатной температуре. Экстракт алкилировали, прогревали в течение двух минут на кипящей водяной бане и наносили в объеме 14 мкл в карманы 10 %-ного полиакриламидного геля. Подготовка гелей и электрофорез проводились методом Laemmli (1970), в модификации К.М.Булатовой (1985) [8]. В качестве маркера молекуляр­ных масс использовали набор Thermo scientific (Литва) (170 кДа, 130 кДа, 100 кДа, 70 кДа, 55 кДа, 40 кДа, 35 кДа, 25 кДа, 15 кДа, 10 кДа). Обработку полученных результатов проводили с помощью кластерного анализа методом Ward.

Результаты исследований и обсуждение

Анализ спектра запасных белков сорта эспарцета Алма-Атинский 2 на уровне единичных семян (рис. 1) показал его чрезвычайное разнообразие как по подвижности в геле, так и по интенсивности проявления компонентов.

В целом в спектре белков насчитывалось от 25 до 37 компонентов, с молекулярной массой от 10 до 115 кДа. Наименее вариабельной была зона компонентов с молекулярной массой от 10 до 20 кДа, по зоне медленно-подвижных компонентов (75-115 кДа) у большинства семян наблюдалось сходство, но, тем не менее, у отдельных семян (№ 3, 5, 10, 11, 13) имелись отличия по числу и подвижности компонентов в геле. Наиболее гетерогенной и специфичной для каждого семени была зона компонентов с молекулярной массой от 25 до 70 кДа.

Известно значительное разнообразие видов эспарцета по морфологическим, анатомическим ха­рактеристикам, молекулярным маркерам [9]. Исследования изозимного состава фермента эстеразы также выявили высокий уровень межвидового разнообразия рода Onobrychis Mill. и генетического полиморфизма 3 популяций вида Onobrychis viciifolia, уникальность спектра изоформ для значитель­ной части генотипов [10].

Длительное возделывание сорта Алма-Атинский 2 могло отразиться на его внутрипопуля-ционном разнообразии, однако уже в период его создания и передачи на Госсортоиспытание сорт со­стоял из растений, различающихся по целому комплексу морфобиологических и хозяйственно-ценных признаков. Растения эспарцета, входящие в состав популяции сорта, различались между со­бой по кормовой и семенной продуктивности, укосности, типу развития, темпам роста, дате наступ­ления фенофаз, кустистости, облиственности, форме куста и розетки листьев, выживаемости и дру­гим показателям и свойствам. Различие между растениями внутри популяции сорта Алма-Атинский 2 по основному показателю — продуктивности — достигало огромных размеров (превышение в 10-15 раз), а по содержанию протеина составляло 3,93 % [4].

На рисунке 2 приведен электрофоретический спектр 8-ми образцов эспарцета закавказского и 9-ти образцов эспарцета песчаного из географически отдаленных регионов. Внутривидовое разнооб­разие коллекционных образцов по составу запасных белков семян было также значительным.

Вместе с тем специфических, характерных только для конкретного вида эспарцета особенностей спектра нами не выявлено. Методом кластерного анализа данных компонентного состава запасных белков анализированные генотипы, идентифицированные по наличию-отсутствию определенных полос и их интенсивности в спектре, распределились на 3 основных кластера, включающих образцы как закавказского, так и песчаного видов соответственно (рис. 3).

Рисунок 3. Дендрограмма распределения коллекционных образцов эспарцета по сходству-различию компонентного состава запасных белков семян

Ввиду того, что для анализа внутривидовой полиморфности коллекционных образцов эспарцета песчаного и закавказского использовались единичные семена, отдельные коллекционные номера (эс­парцет закавказский, Натехтерский, Грузия и эспарцет песчаный, Донецкий-21, Украина) были оце­нены по составу белков на большем числе семян (рис. 4). На электрофореграмме, кроме маркера мо­лекулярных масс (М), приведен для сравнения спектр глобулинов сои (С).

Высокий уровень разнообразия, выявленный нами в пределах сорта Алма-Атинский 2, коллекционных номерах, согласуется с результатами оценки генетической изменчивости различных популяций Onobrychis viciifolia RAPD маркерным анализом, который показал, что наибольшее разнообразие сосредоточено внутри популяции, нежели между ними [11, 12]. Авторы связывают вы­сокий уровень межвидового и внутрипопуляционного полиморфизма эспарцета с перекрестным опы­лением вида, хотя не всегда вариабельность признаков в пределах вида и популяций связана с характером опыляемости растений. Так, люцерна (Medicago sativa) также является перекрестно-опыляемой культурой, в то же время меж- и внутрисортовой полиморфизм по ДНК-маркерам и за­пасным белкам у нее незначителен [13-15]. Другой причиной высокой генетической вариабельности популяций могут являться стрессовые условия, при которых чаще всего произрастает эспарцет. Так, известны исследования, доказывающие, что популяции, испытывающие неблагоприятные природные условия, характеризуются высокой генетической вариабельностью [16-18].

Рисунок 4. Спектр запасных белков единичных семян эспарцета закавказского и песчаного

Следует отметить, что генетическое разнообразие, выявленное на основе морфофизиологи-ческих, анатомических, биохимических и других показателей растения, а также на уровне изофер-ментных и ДНК-маркеров, для которых задействованы вегетативные органы, характеризует состоя­ние генома растений, реализующих на момент скрининга генетический потенциал, переданный через семенную фазу, тогда как внутривидовое и внутрипопуляционное разнообразие, оцениваемое по спектру запасных белков семян, дает информацию о степени полиморфности и гетерозиготности бу­дущих сортовых популяций.

Для решения качественно новых задач по селекции эспарцета необходимо учитывать огромное генетическое разнообразие видов и популяций по белковым и молекулярным маркерам, которое мо­жет быть связано с хозяйственно-ценными признаками растений, всесторонне и глубоко изучать био­логические и хозяйственно-ценные признаки не только сортов и образцов, но и каждого растения, с использованием традиционных и современных, маркерных методов селекции.

Список литературы

1. Miiler D.A., Hoveland C.S. Other temperate legumes // Barnes R.F., Miller D.A. and Nelson C.J. (eds) Forages. Vol. 1 An in­troduction to grassland agriculture, 5^th edn, Ames., IA, USA: Iowa State University Press, — P. 273-281.
2. Frame J., Charlton J.F.L., Laidlaw A.S. Temperate forage legumes. — Wallington, UK: CAB International, — P. 279­287.
3. Люшинский В.В., Прижуков Ф.Б. Семеноводство многолетних трав. — М.: Колос, 1973. — С. 87-100.
4. Голубев А.М. Результат селекции эспарцета на юге Казахстана // Селекция и семеноводство кормовых трав на юге и юго-востоке Казахстана. Вып. 3. — Алма-Ата: Кайнар, 1979. — С. 60-69.
5. Фицев А.И. Проблемы и перспективы производства кормового белка в России // Кормопроизводство. — 2003. — № 10. — С. 25-29.
6. Emre I., Turgut-balik D., Sahin A., Kursat M. Total electrophoretic band patterns of some onobrychis species growing in tur­key // American-Eurasian J. Agric and Environ Sci. — 2007. — 2(2). — P. 123-126.
7. Arslan E., Ertugrul K. Genetic relationships of the genera Onobrychis, Hedysarum, and Sartoria using seed storage protains // Turk J. Biol. — 2010. — 34. — P. 67-73.
8. Булатова К.М. Изучение компонентного состава глютенина пшеницы // Вестн. с.-х. науки Казахстана. — 1985. — № 4. — С. 37-39.
9. Zarrabian M., Majidi M.M., Ehtemam. Genetic diversity in a wordwide collection of sainfoin using morphological, anatomi­cal and molecular markers // Crop Science. — 2013.
10. Kidambi S.P., Mahan J.R., Matches A.G., Burke J.J., Nunna R.R. Genetic variability for esterase enzyme in Onobrychis spe­cies // Theor. Appl. Genet. — 1990. — 80. — P. 433-436.
11. Nosrati H., Fezi M.H., Tarrah S.S., Haghighi A.R. Population genetic variation in sainfoin (Fabaceae) revealed by rapid markers // Fascicula Biologie. — 2012. — Vol. XIX, Iss. 1. — P. 11-16.
12. , Jafari A.A., Tabaei-Aghdaei S.R., Shanjani P.S., Darvish F. Assessment of genetic variability of 36 population of Sainfoin // International Journal of Biosciences. — 2013. — Vol. 3, № 10. — P. 15-26.
13. Crochemore M.L., Huyghe C., Kerlan M.C., Durand F., Jukier B. Partioning and distribution of RAPD variation in a set of populations of the Medicago sativa complex // Agronomie. — 1996. — № 16. — 421-432.
14. Krochko J.E., Bewley J.D. Seed storage proteins in cultivars and subspecies of alfalfa // Seed Science Research. — 2000. — 10(4). — P. 423-434.
15. Habibi B., FarshadfarM., Safari H. Evaluation of genetic diversity among 18 Lucerne genotypes (Medicago Sativa L.) using SDS-PAGE Markers // Int. J. Agri. Crop Sci. — 2012. — 4(21). — P. 1623-1626.
16. Van Valen L. Morphological variation and width of ecological niche // American Naturalist. — 1965. — 99. — P. 377­390.
17. Brock J., Aboling S., Stelzer R., Esch E., Papenbrock. Genetic variation among different populations of Aster tripolium grown on naturally and anthropogenic salt-contaminated habitats. Implications for conservation strategies // Journal of Plant Re­sea — 2007. — Vol. 120. — P. 99-112.
18. Nevo E., Baum B., Beiles A., Johnson D.A. Ecological correlates of RAPD DNA diversity of wild barley, Hordeum spontaneum, in the Fertile Crescent // Genetic Resources and Crop Evolution. — 1998. — 45. — P. 151-159.