Характеристика методов определения инфекций вирусной природы

В статье изложены основные методы определения вирусных агентов: вируса простого герпеса I и II типов, цитомегаловируса, вируса папилломы человека. Описаны цитологические, цитоморфологические методы, иммуноферментный анализ, метод прямой иммунофлюоресценции; иммунофлюорес-центный метод со связыванием комплемента, серологические методы. Представлены преимущества и недостатки каждого из методов. Обозначена полимеразная цепная реакция, обладающая наибольшей чувствительностью и специфичностью. Указаны разновидности полимеразных цепных реакций (ПЦР), отмечены преимущества ПЦР в режиме реального времени.

Инфекционные болезни вирусной природы на протяжении многих столетий были и остаются наиболее опасными болезнями человеческого организма из-за их способности вовлечь в процесс большое число здоровых людей в течение короткого периода времени, а также из-за недостаточной изученности молекулярно-генетических механизмов агентов, вызывающих заболевание.

Появляются новые виды инфекционных возбудителей (вироиды), происходит изменение макро­организма, претерпевают существенные изменения условия жизни под действием экологических и социальных факторов, что оказывает значительное влияние на течение и исходы инфекционных бо­лезней, поэтому необходимо следить за современными достижениями медицины и биологии, обеспе­чивающими новые возможности определения и диагностики болезнетворных агентов.

В данной статье будут рассмотрены некоторые инфекционные агенты вирусной природы и ос­новные методы их определения для выявления наиболее точного и достоверного метода, не требую­щего больших материальных и временных затрат.

Вирусные инфекции представляют собой одну из многочисленных групп инфекционных заболе­ваний разнообразных по клиническому течению и морфологии [1].

Вирус — субклеточный инфекционный агент, который может воспроизводиться только внутри живых клеток организма [2]. По природе вирусы являются автономными генетическими элементами, имеющими внеклеточную стадию в цикле развития и, за редким исключением, содержат только один тип геномной нуклеиновой кислоты [3]. Вне клетки вирусные частицы не проявляют признаков жи­вого и ведут себя как частицы органических полимеров. От живых организмов — внутриклеточных паразитов отличаются полным отсутствием основного и энергетического обмена и отсутствием сложнейшего элемента живых систем — аппарата трансляции (синтеза белка), степень сложности которого превышает таковую самих вирусов [4].

Определение вируса простого герпеса I и II типов (Herpes simplex virus I и II)

Herpes simplex virus I и II (вирус простого герпеса — ВПГ 1 и 2) входят в состав семейства гер-песвирусов, включающих более 90 герпесвирусов человека и животных [5]. Герпесвирусы представ­лены структурно однородной группой вирусов, содержащих двухцепочечную линейную ДНК. Это крупные вирусы (средний диаметр 100 нм), отличающиеся сложной организацией вириона. Размно­жение вирусов от репликации до образования вирусных частиц происходит в ядре инфицированной клетки [6].

Уникальными биологическими свойствами всех герпесвирусов человека является способность к персистенции и латенции в организме инфицированного человека. Персистенция представляет со­бой способность герпесвирусов непрерывно или циклично размножаться (реплицироваться) в инфи­цированных клетках тропных тканей, что создает постоянную угрозу развития инфекционного про­цесса. Латенция ВПГ — это пожизненное сохранение вирусов в морфологически и иммунохимически видоизмененной форме в нервных клетках регионарных (по отношению к месту внедрения герпесви-руса) ганглиев чувствительных нервов [5].

Herpes simplex I вызывает первичный герпетический гингивостоматит с характерными пораже­ниями многослойного эпителия красной каймы губ. Herpes simplex II вызывает генитальный гер­пес — характерные поражения гениталий [7].

В большинстве случаев характерные поражения слизистых оболочек и кожи определяют пра­вильный диагноз герпесной инфекции. Однако существуют скрытые формы заболевания, ведущие к осложнениям, а в латентной фазе вирус себя никак не проявляет. Лабораторная диагностика ВПГ до последнего времени оставалась актуальной задачей медицины [8].

В качестве биологического материала для проведения исследования можно использовать содер­жимое везикул, смывы с тканей и органов, мазки-отпечатки, соскобы, биологические жидкости и секреты организма (кровь, слизь, моча, слезная жидкость, СМЖ) [9].

Для диагностики герпетической инфекции используются следующие методы:

1. Цитоморфологические методы — позволяют выявить индуцированные вирусом морфоло­гические изменения в клетках и тканях пораженных органов. Эти методы делятся на две группы: в одних используется световая, в других электронная микроскопия [6].

Материалом для цитологического исследования может служить содержимое везикул, соскоб со дна эрозии, слизистой уретры, стенок влагалища, канала шейки матки.

После нанесения материала на предметное стекло препарат высушивают, фиксируют и окраши­вают. Существует несколько методов окраски для цитологического исследования мазков на ВПГ. Наиболее часто применяют окрашивание по Романовскому-Гимзе [10].

При использовании световой микроскопии в зонах поражения отмечается типичный для герпеса метаморфоз клеток и их ядер. Размер клеток увеличен. Они имеют крупные, гиперхромные ядра, со­держащие базофильные включения, окруженные зоной просветления. Определяются внутриядерные ДНК-содержащие включения, многоядерные клетки [9]. В местах поражения тканей отмечается нек­роз, лимфоплазмоцитарная реакция различной степени выраженности, разрыхления пласта эпителия, утолщение кариолеммы (очаговые редупликации), маргинация хроматина, скопление хроматина в глыбки, полный лизис ядерных веществ, цитоплазма вакуолизируется и даже может исчезнуть (ос­таются «голые» ядра) [6].

Электронно-микроскопическое исследование позволяет обнаружить в биопробах характерные по морфологии частицы ВПГ при негативном контрастировании. Этот метод требует достаточно вы­сокой концентрации возбудителя в пораженной ткани (10¹⁰ частиц в 1 мл суспензии). Дифференциа­ция ВПГ от других морфологически неотличимых представителей семейства герпесвирусов может быть выполнена при комбинации электронной микроскопии с использованием специфических анти­тел против соответствующих штаммов ВПГ, меченных электронно-плотными маркерами — перокси-дазой хрена или ферритином [11].

Цитоморфологические методы диагностики являются наиболее доступными и технически про­стыми. Диагностическая ценность метода может достигать до 2/3 от эффективности выделения виру­са в культуре тканей. К достоинствам следует отнести высокую диагностическую значимость при бессимптомном течении инфекции (цервициты, уретриты) [7]. К недостаткам цитоморфологических методов с использованием световой микроскопии следует отнести их неспецифичность (нали­чие многоядерных клеток и внутриядерных включений характерно и для других вирусов, например, вируса ветряной оспы — герпес зостер), невозможность дифференцирования первичной инфекции ВПГ от рецидивирующей, типа ВПГ [10].

Иммунофлюоресцентный метод — основан на непосредственном связывании антигенов ви­руса простого герпеса с мечеными флюорохромом антителами и последующей микроскопии иссле­дуемого материала с полученными комплексами антиген-антитело в ультрафиолете. Под воздействи­ем ультрафиолетового излучения флюорохром дает свечение, что позволяет быстро выявить наличие возбудителя в исследуемом материале [9]. Для оценки интенсивности специфического свечения ис­пользуют четырехкрестовую систему:

++++ — яркие сверкающие изумрудно-зеленые клетки, люминесцирующие по периферии, четко контрастирующие с темным телом клетки;

+++ — умеренная изумрудно-зеленая люминесценция периферии клетки;

++ — зеленое свечение всей клетки;

+ — едва заметная зеленая люминесценция всей клетки [11].

Для идентификации ВПГ используют следующие методы флюоресцентного окрашивания:

метод прямой иммунофлюоресценции используется при исследовании соскобов слизистых. Метод позволяет выявить вирус простого герпеса (HSV1, 2) в клетках эпителия [6].

На исследуемые препараты наносят 0,02-0,05 мл флюоресцирующей специфической сыворотки (поликлональной или моноклональной), содержащей БСА (бычий сывороточный альбумин), мечен­ной родамином или синькой Эванса. Их используют как контрастирующие вещества, на контрольные препараты наносят конъюгированную отрицательную или гетерогенную сыворотку, желательно про­водить контрольное исследование и с предметными стеклами, на которые нанесен препарат, содер­жащий ВПГ [11].

Мазки просматриваются под люминесцентным микроскопом, используя масляную имерсию [5]. При оценке результатов обращают внимание на характер и количество антигенсодержащих клеток, локализацию специфического свечения и его интенсивность. ДНК-содержащие ядра окрашиваются в зеленый цвет. Цитоплазма обычно также окрашивается в зеленый цвет. При усиленном метаболиз­ме клеток РНК цитоплазмы и ядра имеет красноватый оттенок. Вирусные включения в цитоплазме и ядре могут иметь различную окраску — от красных незрелых (РНК-содержащих), до желто-зеленых зрелых (ДНК-содержащих) включений различной формы и размеров [9].

Положительным считается мазок, в котором содержится не менее 3 морфологически не изме­ненных клеток эпителия, с интенсивной специфической флюоресценцией типичной локализацией не менее чем на ++. Для ВПГ характерна локализация в ядре, ядре и цитоплазме одновременно [11]:

иммунофлюоресцентный метод со связыванием комплемента. Его преимуществом являет­ся применение только одного типа, флюоресцирующего конъюгата — сыворотки иммунной к глобу­лину морской свинки. Конъюгированная сыворотка фиксируется в тех местах препарата, где антиген адсорбирует специфические антитела [8].

Иммунофлюоресцентный метод со связыванием комплемента в настоящее время применяют крайне редко, так как комплемент быстро теряет свою активность и может использоваться не для всех реакций между антигеном и антителом [7].

Анализ материала осуществляется при помощи люминесцентного микроскопа с сине-фиолетовой части спектра, используют объектив и иммерсионную систему [9].

В эпителиальных клетках, пораженных ВПГ, выявляются яркие свечения гранул в ядрах, неред­ко обнаруживаются включения в цитоплазме или гранулы на кариолемме и поверхности эукариоти-ческих клеток, диффузное свечение цитоплазмы [8].

Таким образом, при использовании метода иммунофлюоресценции частота подтверждения гер-песвирусной этиологии достигает, в зависимости от стадии заболевания, 15-45 %. Длительность по­становки реакции составляет 1-1,5 часа. Однако описанный метод не обладает достаточной специ­фичностью и чувствительностью, но может быть применен как вспомогательное диагностическое средство [9].

Серологические методы. Обнаружение антигенов ВПГ в биологических жидкостях организ­ма или в клетках является прямым доказательством активной репликации вируса и, следовательно, однозначно подтверждает этиологию заболевания [12]. Для выявления антигенов ВПГ в биологиче­ском материале, полученном от больных, используются серологические методы: реакция связывания комплемента (РСК); реакция нейтрализации (РН); реакция пассивной гемагглюцинации (РПГА); ра­диоиммунный анализ (РИА); иммуноферментный анализ (ИФА).

Принцип этих методов основан на выявлении антигенов ВПГ с помощью специфических анти­тел, либо поликлональных, полученных при иммунизации животных антигенами ВПГ, либо моно-клональных, полученных с помощью гибридомной технологии. В основе всех этих методов лежит реакция специфического связывания антиген-антитело. Различия методов заключаются в способах регистрации и учета этой реакции. В настоящее время классические серологические реакции типа РСК, РН, РПГА, в силу их низкой чувствительности, высокой трудоемкости, малой пригодности к автоматизации, отступили на второй план [9].

Все большее распространение получают методы ИФА, в которых, как правило, применяются моноклональные антитела, отличающиеся высокой специфичностью [7].

Исследование сыворотки крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) на наличие анти­тел к герпесвирусам поможет установить, есть ли носительство и фазу заболевания (первичный ост­рый процесс, латенция или вторичное обострение — рецидив) [5].

Так как IgM вырабатываются, как правило, только при первичной инфекции, и в лабораторной диагностике они являются маркерами первичной герпесвирусной инфекции. Из-за низкой специфич­ности IgM они могут перекрестно реагировать (с ревматоидным фактором, например) и давать ложноположительные результаты.

Для исключения ошибки необходимо проверить наличие низкоавидных IgG или повторить ис­следование IgM через 2 недели (метод парных сывороток): при развитии первичного процесса долж­ны вновь выявиться IgM и появиться низкоавидные IgG. Если низкоавидные IgG не появились, а IgM выявились снова, то этот положительный результат надо считать ложным [13].

Наиболее специфичными маркерами первичной герпесвирусной инфекции являются низкоавид-ные IgG. Они никогда не вырабатываются при повторном заражении или рецидиве. При необходимо­сти проводят определение титра антител в динамике [11].

Количество поздних IgG у носителей может варьировать в зависимости от стадии заболевания, от состояния иммунной системы пациента вообще и на момент обследования в частности. Поэтому количественный показатель IgG далеко не всегда обладает диагностической ценностью [8].

Итак, для вирусоносителей единственный надежный тест для определения активности герпесви-русов — это выявление IgG к предранним белкам вирусов (полуколичественно). Появление их в лю­бом титре свидетельствует об активности вирусной инфекции. Увеличение титра через 1-3 недели свидетельствует о развитии рецидива.

Выявление поздних, высокоавидных IgG при отсутствии IgG к предранним белкам вирусов сви­детельствует о спокойном носительстве, латентной фазе.

Выявление IgM, низкоавидных IgG и предранних IgG при отсутствии поздних IgG — свидетель­ствует о первичном инфекционном процессе.

Отсутствие поздних IgG, IgM и IgG к предранним белкам герпесвирусов, т.е. серонегативность в отношении данных вирусов, означает отсутствие ВПГ 1,2 в организме [13].

При оценке диагностической ценности серологических методов следует учитывать, что специ­фичность выявления антигенов ВПГ весьма высока, но не абсолютна. Существуют широкие перекре­стные антигенные связи ВПГ человека 1-го и 2-го типов с другими герпесвирусами человека (виру­сом Эпштейна-Барр, цитомегаловирусом, вирусом ветряной оспы), а также герпесвирусами живот­ных и птиц. Так, нарастание титра антител в крови может быть связано с обострением хронической герпетической инфекции, а с другой стороны — развитие герпетического энцефалита, например, мо­жет протекать на фоне стабильного нарастания уровня антител, который был достигнут в результате предшествовавшей инфекции [9]. Чувствительность ИФА достаточно высокая, частота подтвержде­ния герпесвирусной этиологии заболевания составляет в остром периоде до 50-75 %, при хрониче­ском рецидивирующем течении — до 35-45 % [13].

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — наиболее широко используемый в настоящее время метод диагностики герпетических инфекций человека, который предложил Мюллис в 1983 г. В основе метода лежит катализуемое ферментом ДНК-полимеразой многократное образование копий (амплификация) определённого участка ДНК, представляющего диагностический интерес. При этом для амплификации, т.е. синтеза ДНК-матрицы, отбирают наиболее консервативную часть вирусного генома, обычно какой-нибудь уникальный ген, который наиболее чётко отличает его от прочих пато­генов [14]. Для ВПГ 1 и ВПГ 2 это фрагмент гена, кодирующего один из гликопротеинов капсида. У всех других герпесвирусов этот фрагмент представлен другой последовательностью ДНК. Чувст­вительность метода позволяет определить одну молекулу искомой ДНК в образцах, содержащих 10 клеток [15].

Различают качественный, полуколичественный и количественный варианты метода. При проведении качественной ПЦР можно определить лишь факт присутствия ВПГ, однако невозможно оценить его репродуктивную активность, что неприемлемо при диагностике герпетических инфек­ций, при которых необходимо проводить дифференциальный диагноз между латентными, персисти-рующими и реактивированными формами инфекции. Полуколичественная ПЦР даёт определённую информацию о содержании копий вирусных ДНК, которая выражается в виде условных обозначений (+, ++, +++, ++++), однако наиболее целесообразно проводить именно количественный вариант мето­да, при котором можно получить точные числовые значения [12].

Необходимо отметить, что полученный количественный результат не соответствует истинному содержанию ДНК возбудителя в исследуемой пробе ввиду феномена амплификации, который имеет место при проведении ПЦР. Однако всё же имеется определённая пропорциональность между исход­ным количеством генетического материла и конечным результатом исследования, которая соблюда­ется лишь в случае проведения диагностики в стандартных условиях, с использованием одних и тех же реактивов. Поэтому такие данные можно применять в клинической диагностике, если проводить обследование пациента в динамике в одной и той же лаборатории. Если же необходимо установить абсолютное количество вирусной ДНК в пробе, то проводят нормализацию полученных результатов (сравнение с количеством продуктов некоторых стабильных генов, экспрессия которых одинакова при различных условиях) [15].

Чувствительность ПЦР в определении ВПГ 1 и 2 составляет 98 %, а специфичность — 94 % [8]. Ложноотрицательные результаты возможны при несоблюдении технологических процедур проведе­ния исследования, а также при использовании некачественных реактивов. Ложноположительные данные можно получить при подсчёте результатов методом электрофореза, что связано с контамина­цией воздушной среды рабочего пространства ампликонами, полученными в ходе предварительных постановок. Поэтому использование так называемых открытых методик подсчёта результатов требу­ет проведения интенсивной вентиляции помещений. Гораздо лучше использовать закрытые методики подсчёта, например, иммунофлуоресцентные детекторы, при которых нет прямого контакта между продуктами реакции и воздушной средой, а результаты исследования являются более корректны­ми [15].

Наиболее точной является методика так называемой real-time ПЦР, т.е. ПЦР в реальном време­ни. Её отличительным свойством является подсчёт количества амплифицированных ДНК по мере их накопления после каждого амплификационного цикла, а не в конце постановки.

Однако даже количественная ПЦР не всегда позволяет адекватно разграничить латетные и реак­тивированные формы герпесвирусной инфекции, так как в обоих случаях имеет место наличие ви­русной ДНК [7].

Таким образом, следует отметить, что ни один из методов лабораторной диагностики Herpes simplex I и II не обладает 100 %-ной чувствительностью и специфичностью. Повышение достоверно­сти лабораторной диагностики за счет исключения ложноотрицательных и ложноположительных ре­зультатов может быть достигнуто путем одновременного применения нескольких методов тестиро­вания, базирующихся на разных принципах (например, выявление ДНК вируса методом ПЦР и опре­деление герпетического антигена, противовирусных М-антител или низкоавидных G-антител мето­дом ИФА).

Определение цитомегаловируса (Cytomegalovirus, CMV) Цитомегаловирус (ЦМВ) принадлежит к семейству Herpesviridae, подсемейству Eetaherpes-virinae и имеет видовое название Human herpes virus 5 (HHV5) (официальное название) или Cytomegalovirus (обычное название) [4].

Жизненный цикл ЦМВ является сложным многоступенчатым процессом. ДНК вируса становит­ся транскрипционно активной только при проникновении в ядро клетки. В первую очередь происхо­дит транскрипция предранних генов (IE) и синтез соответствующих им белков, обладающих регуляторными функциями дальнейшей экспрессии вирусного генома. Далее синтезируются белки ранних (Е) генов, которые, как полагают, играют важную роль в репликации вирусной ДНК. Наконец, позд­ние (L) белки, большая часть которых представлена структурными полипептидами, образуются при наличии вновь синтезируемого вирусного генома и ранних белков [16].

Цитомегаловирус вызывает цитомегаловирусную инфекцию — широко распространенную ви­русную инфекцию, характеризующуюся многообразными проявлениями — от бессимптомного тече­ния до тяжелых форм с поражением внутренних органов и центральной нервной системы.

В настоящее время известно 3 штамма ЦМВ. Вирус развивается в культуре человеческих фибробластов [17].

Определение цитомегаловируса может осуществляться следующими методами:

1. Цитологический метод. В окрашенных препаратах мочи, слюны, ликвора, слизистой цервикального канала, грудного молока выявляют специфически изменённые «цитомегалические гигант­ские клетки». Исследование проводят многократно, не менее 3 в день, в течение 3-5 дней. Цитологи­ческий метод является простым и доступным, но обладает невысокой чувствительностью (около 50 %) [9].

2. Серологический анализ. Для тестирования сывороток применяют в основном иммуноферментный анализ (ИФА). В качестве антигена обычно используют экстракты лизированных, инфици­рованных вирусом клеток или очищенные вирусные частицы [18].

В контексте диагностики ЦМВ выделяются IgG и IgM:

• ОпределениеIgG свидетельствует о перенесенном в прошлом инфицировании и контакте им­мунной системы с вирусом, позволяет выявить латентную ЦМВИ. Однако диагностической ценности данный анализ не имеет. Большую диагностическую ценность имеет количественный анализIgG— повышение титра антител в 4 раза от исходного является признаком активности инфекции или пер­вичного поражения.
• ОпределениеIgM. НаличиеIgM в сыворотке крови может расцениваться как показатель теку­щей инфекции — первичной или рецидивирующей. Данный класс антител первым синтезируется иммунными клетками в ответ на контакт с инфекционным агентом. Это происходит спустя несколько дней после первичного контакта [19].

Однако количественный анализ на IgG позволяет выявить активный процесс или первичное ин­фицирование лишь при проведении серии анализов в течение длительного времени (оценка динамики титра антител). Также ограничения метода связаны с низким уровнем IgM в тестируемой сыворотке или их возможным отсутствием в случаях рецидивирующей инфекции и у лиц с иммуносупрессией. Возможны ложноположительные результаты, обусловленные наличием ревматоидного фактора клас­са М [18].

В ряде случаев в процессе диагностики возникает необходимость исследования некоторых функциональных особенностей антител, таких как аффинность и авидность [18]. Аффинность — степень сродства антитела антигену (компонент вируса). Авидность — прочность соединения в комплексе антитело-антиген [20].

Между данными понятиями имеется прямая взаимосвязь — чем лучше антитела соответствуют антигену, тем прочнее их связь при взаимодействии. К примеру, индекс авидности до 30 % свиде­тельствует о наличии низкоавидных антител и соответственно о первичной инфекции, 30-40 % — о поздней стадии первичной инфекции или недавней перенесенной инфекции, индекс свыше 40 % — о давней перенесенной инфекции [18].

Таким образом, имеющаяся иногда несогласованность между параметрами иммунного ответа и клиническими проявлениями накладывает дополнительные ограничения на серологический анализ в диагностике ЦМВИ. Это обусловлено особенностями иммунного ответа при данном заболевании, часто возникающем на фоне иммунодефицитного состояния пациента. Поэтому важную роль в по­становке диагноза ЦМВИ играет определение вирусных антигенов и вирусной ДНК.

Вирусологический метод — один из традиционных методов лабораторной диагностики ЦМВИ. Он заключается в культивировании клеток фибробластов, инфицированных биологической жидкостью пациента. Возникшие морфологические изменения клеток указывают на наличие вируса в исследуемом образце. Длительность процесса (3-4 недели), цитотоксичность некоторых образцов (моча, слюна), слабая выраженность морфологических изменений при сопутствующих инфекциях существенно ограничивают использование данного метода [21].

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет выявлять ДНК с высокой чувстви­тельностью — 10-100 геномов ДНК ЦМВ на исследуемую пробу [19].

Метод ПЦР благодаря своей высокой чувствительности выявляет даже отрезок ДНК ЦМВ и считается весьма прогрессивным. Наиболее важное его преимущество — возможность диагностики ранних стадий процесса, латентной и персистирующей инфекции, однако он имеет существенные недостатки: во-первых, низкая прогностическая ценность, связанная с тем, что ПЦР выявляет ДНК вируса даже в латентном состоянии, во-вторых, этот метод недостаточно специфичен [22].

Таким образом, в связи со сложностью развития цитомегаловирусной инфекции, часто проте­кающей на фоне иммунодепрессивного состояния, с наличием первичной, латентной и рецидиви­рующей инфекций, имеющимися фактами несогласованности между параметрами иммунного ответа

и клиническими проявлениями наиболее часто применяемыми являются серологические методы и полимеразная цепная реакция, однако для получения более точного результата рекомендуется ис­пользовать комбинированную диагностику.

Определение вируса папилломы человека

Вирус папилломы человека (ВПЧ, HPV — Human Papillomavirus) относится к подгруппе А се­мейства паповирусов (Papoviridae) [3]. Репродукция ВПЧ происходит в ядрах клеток, где вирусная ДНК присутствует в виде эписомы. Это первая особенность, отличающая ВПЧ от других онкогенных ДНК-содержащих вирусов (вирус гепатита В — семейство паднавирусов и вирус Эпштейна-Барра — семейство герпесвирусов), которые могут встраивать свой геном в ДНК трансформированной клетки. Вторая особенность заключается в том, что состояние клетки хозяина регулирует экспрессию вирус­ного генома [23].

Как происходят репликация вируса, сборка вирусных частиц и их высвобождение из клетки счи­тать полностью установленными еще нельзя. [24]

В зараженной клетке вирус существует в двух формах — эписомальной (вне хромосом клетки), которая считается доброкачественной формой, и интросомальной и интегрированной (встраиваясь в геном клетки), которую определяют как злокачественную форму паразитирования вируса [23].

ВПЧ не размножаются в культуре клеток, поэтому сведения о биологии вирусов получены с по­мощью молекулярно-генетических технологий и эпидемиологических исследований. Показано суще­ствование 100 типов, отличающихся по строению ДНК, 75 из них молекулярно клонированы и пол­ностью секвенированы. Типирование ВПЧ основано не на антигенных различиях, а на ДНК-гомо­логии [24].

Благодаря молекулярно-гибридизационным методам стало известно, что 30 из всех типов папил-ломавирусов инфицируют половые органы и область заднего прохода. Различают высокоонкогенные, низкоонкогенные типы ВПЧ, а также группу промежуточного риска, выделяемую некоторыми авто­рами. К высокоонкогенным относятся 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 и 82 типы ВПЧ, к низкоонкогенным — 6, 11, 30, 42, 43, 44 типы, наличие промежуточного онкориска предпола­гается у 26, 53 и 66 типов [25].

В клинической практике преобладает инфицирование высокоонкогенными 16 и 18 типами, с ко­торыми связаны около 70 % случаев рака шейки матки, а также низкоонкогенными 6 и 11 типами, вызывающими около 90 % остроконечных кондилом [26].

Диагностика вируса папилломы человека может осуществляться следующими методами:

Цитологический анализ мазка — метод выявления морфологических изменений клеток, в том числе связанных с ВПЧ [9]. Клетки для исследования берутся с поверхности шейки матки. Каче­ство результата в значительной мере зависит от квалификации врача-цитолога (трактовка субъектив­на) и от выбора способа окрашивания. Наиболее информативным методом окрашивания является ме­тод Папаниколау [23].

Характерным цитологическим признаком папилломавирусного поражения является так назы­ваемая койлоцитарная атипия [27].

Койлоциты — клетки плоского эпителия неправильной формы с четкими границами. Размер их может быть разным, но обычно они крупнее, чем клетки соответствующего им слоя. Располагаются преимущественно разрозненно или небольшими группами. Цитоплазма обильная, характерно нали­чие обширной околоядерной зоны просветления, полости или нескольких полостей, четко отграни­ченных от периферических отделов цитоплазмы, которые окрашиваются более равномерно и интен­сивно [9].

Околоядерную зону просветления обнаруживают не только при папилломавирусной инфекции, но и при других изменениях эпителия, в частности, при плоскоклеточной метаплазии.

При доброкачественных поражениях вирусные частицы располагаются эписомально, при ра­ке — встроены в геном клеток [27].

Специфичность метода составляет 90-97 %. Однако не следует забывать о следующих сущест­венных недостатках цитологического исследования:

1) анализ позволяет диагносцировать только клиническую и субклиническую формы инфекции;

2) существует возможность появления ложноот-рицательных результатов при наличии плоскоклеточных интраэпителиальных поражений высокой степени тяжести (в мазок попадают чаще всего поверхностные клетки плоского эпителия, а койлоци-тоатипия может наблюдаться в более глубоких слоях многослойного плоского эпителия);

3) чувстви­тельность цитологических методов для обнаружения поражений шейки матки варьирует от 50 до 80 %, что может быть отчасти компенсировано повторением теста через короткие промежутки вре­мени [23].

Метод ПЦР позволяет осуществить выявление и типирование ВПЧ. Метод может быть ис­пользован для анализа различных образцов: мазков, соскобов, смывов, биоптатов и тканей, заклю­ченных в парафин. Пробы можно получить неинвазивным путем [9].

Наборы ВПЧ-праймеров гибридизируются с высоконсервативными генами L1, которые кодиру­ют капсидный белок. Для детекции продуктов амплификации используют набор длинных (400 п. н.) зондов, позволяющих определить тип вируса. Другой набор ВПЧ-праймеров гибридизуется с ранни­ми генами Е6, которые сохраняются и после того, как вирусная ДНК попадает в клетку [28].

Для идентификации разных типов ВПЧ используют типоспецифические олигонуклеотидные зонды. Этим методом можно выявить даже 10 копий ВПЧ [24].

ПЦР — это наиболее точный из всех возможных методов выявления инфекционных агентов в организме человека. Специфичность метода 100 %, эффективность обнаружения — 98 % [29]. В отличие от иммунологических методов, где о наличии микроорганизма судят исключительно по наличию в крови пациента антител к конкретным возбудителям, ПЦР-диагностика выявляет непо­средственно самого возбудителя или его части даже в предельно малых концентрациях, что делает метод ПЦР наиболее точным и чувствительным [30].

ПЦР-диагностика не позволяет установить стадию инфекции, однако однозначно указывает на наличие или отсутствие инфекции. В связи с этим данная группа методов может использоваться только в совокупности с клиническими методами исследования [29].

Дополнительные возможности определения прогноза течения папилломавирусной инфекции может дать проведение генотипирования. Необходимость генотипирования может быть оправданна, так как:

• выявление нескольких генотипов вируса ассоциировано с менее благоприятным прогнозом те­чения заболевания и более высоким риском персистенции;
• степень онкогенности различных генотипов высокого риска не одинакова. Наибольшей онко-генностью обладают 16 и 18 типы ВПЧ, существуют рекомендации по проведению определения этих двух генотипов вируса после теста на широкий спектр типов с целью определения типов обследова­ния;
• проведение генотипирования позволяет отличить реинфицирование от персистентной инфек­ции при повторном визите пациента. Получать подобную информацию тем более важно, так как опасность представляет именно хроническая персистентная форма инфекции, недавнее же инфици­рование наиболее вероятно спонтанно излечивается. О реинфицировании говорит изменение спектра генотипов, о персистентной инфекции — сохранение генотипа вируса через год после первого тести­рования, повторное инфицирование тем же генотипом вируса после самостоятельного излечения практически невозможно [24].

Таким образом, методов, позволяющих определить вирус папилломы человека, не так много, как в отношении других вирусных агентов. Это связано с тем, что ВПЧ не размножаются в культуре кле­ток, а серологический метод диагностики ВПЧ-инфекции не применяется, так как существует огром­ное число серотипов вирусов, вследствие антигенного родства которых нередко отмечают перекрест­ные реакции. Кроме того, до последнего времени не удавалось получить надежные диагностические препараты [30].

Однако исследования показали, что совместное использование ВПЧ-тестирования и цитологии позволяет увеличить чувствительность выявления предрака и рака шейки матки до 96-99 % [29].

На основании изложенного можно сделать вывод о том, что, учитывая преимущества и недос­татки каждого из описанных методов определения инфекционных агентов вирусной природы, наибо­лее эффективным является ПЦР. Метод обладает наибольшей чувствительностью, специфичностью, отличается быстротой получения результата и возможностью выявления вирусного агента даже в ла­тентной форме.

References

1. Skin and venereal diseases (directory) / Ed. O.L.Ivanova. — Moscow: Medicine, — 352 p.
2. Shligel G. General microbiology — Moscow: Mir, — 283 p.
3. General Virology / Ed. Yu.Z.Gendon. — Moscow: Mir, 1981 — 680
4. Borisov L.B. Medical microbiology, virology, immunology. — Moscow: Medicine, 1994 — 736
5. Granitov V.M. Herpes infection. — Moscow: Book Medical, 2001. — 168
6. Karimova I.M. Herpes infection. Diagnosis, clinical features, treatment. — Moscow: MIA, — 120 p.
7. Dyudyun A. Modern aspects of the clinic, diagnosis and treatment of herpesvirus infections // Dermatovenereology. Cos­ Sexologists. — 2006. — Vol. 1. — № 2(9). — P. 214-219.
8. Shulzhenko A.E. Current approaches to diagnosis and treatment of herpesvirus infections // Doctor. — 2007. — № 5. —52-55.
9. Adaskevich V.P., Kozin V.M. Skin and venereal disease. — Moscow: Med. literature, — 672 p.
10. Anokhin V.A. Current principles of clinical and laboratory diagnosis of herpetic infections // Kaz. Med. Journal. — 1999. —№ 2. — P. 127-129.
11. Barinskaja I.F., Shubladze A.K., Kasparov A.A. The etiology, diagnosis and treatment. — Moscow: Medicine, 1986272 p.
12. Kazmirchuk V., Maltsev D.V. Clinic, diagnosis and treatment of human herpesvirus infections: Monograph. — Kiev: Phoe­nix, — 248 p.
13. Peradze T., Halonen P. Immunological diagnosis of viral infections. — Moscow: Med^iM, — 301 p.
14. Theoretical basis of polymerase chain reaction. — Moscow: DNA Technology, — 128 p.
15. V. Modern methods of diagnosis of herpesvirus infections of man and the principles of interpretation of the results // Clinical Immunology. Allergology. Infectology. — 2010. — № 1. — P. 23-32.
16. Emery V.C. Cytomegalovirus infection. — London: Current Medicine Group Ltd, — 63 p.
17. Guseva L.N., Rogov L.A. et al. Cytomegalovirus infection (CMV): Classification and variants of the course // Children's in­ — 2003. — № 1. — P. 57-61.
18. Shakhgildyan V.I., Tishkevich O.A., Shipulina O. Clinical and laboratory characteristics, pathologic features, diagnosis and treatment of cytomegalovirus infection // Infectious Diseases. — 2004. — Vol. 2. —№ — P. 73-80.
19. Ershov F.I., Kasyanov N.V. Cytomegalovirus infection (recent data on the epidemiology, clinical picture, diagnosis and treatment) // Moscow, infection and antimicrobial therapy. — 2002. — Vol. 4. — № — P. 36-39.
20. Shakhgildyan V.I. Cytomegalovirus infection // Lectures on Infectious Diseases. — 3rd ed. / Ed. N.D.Yushchuk, Y.Y. — Moscow: Medicine, 2007. — P. 767-799.
21. Carajas N. Cytomegalovirus infection — a modern diagnostics // Clinical Laboratory Diagnostics. — 1998. — № — P. 16­17.
22. Bashlykova M.V., Masyukova S.A., Karimov I.M. Development of advanced methods of diagnosis and treatment of herpes and cytomegalovirus infections // Journal of Dermatology and Venerology. — 2001. — № 5. — 12-14.
23. Dmitriev G.A., Bitkina O.A. HPV infection. — Moscow: Medical Book, 2006 — 76
24. Dubinsky V. Urogenital human papillomavirus infection (literature review) // Russian Journal of Skin and Sexually Transmit­ted Diseases. — 2000. — № 5 — 50-55.
25. , Mikhalevich S. Human papillomavirus infection in gynecology: the current state // Health News. — 2008. — № 2.
26. 7-9.
27. A., Savicheva A.M. HPV infection. — N.Novgorod: Izd NGMA, 2002. — 20 p.
28. Vasiliev M.M. Modern aspects of human papillomavirus infection of the urogenital tract (clinical picture, diagnosis, treat­ment). — Moscow, — 25 p.
29. Kuevda D.A. HPV testing: diagnostic algorithms and requirements for molecular tests for the detection of human papilloma-virus // Gene diagnostics of infectious diseases: Proceedings of the 6th All-Russian scientific-pract. conf. — Moscow, 2007. — №
30. 108-119.
31. Dolgih T.I., Mikhailova N.A., Gordienko T., Votrina I.R. PCR diagnosis of human papillomavirus infection in women of re­productive age // Gene diagnostics of infectious diseases: Proceedings of the 5th All-Russian scientific-pract. conf. / Ed. V.I.Pokrovsky. — Moscow, — Vol. 1. — P. 29-31.
32. Molochkov V.A. HPV infection. Clinic, diagnosis and treatment: A guide for physicians. — Moscow: Russian Doctor, 2004.