Применение полимеразной цепной реакции в медицине

В статье приведены данные о возможностях применения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в медицине. Описаны принцип и преимущества ПЦР как метода диагностики по сравнению с другими методами (ИФА, бакпосев). Определено, что ПЦР применяют в медицине для диагностики инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний, а также в персонализированной медицине. В статье рассмотрены возможности применения метода ПЦР для диагностики некоторых бактериальных и вирусных инфекций, передающихся половым путем, гепатитов, а также некоторых наследственных и онкологических заболеваний. Отмечено, что в персонализированной медицине ПЦР применяют для определения индивидуальных различии пациентов в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. 

Полимеразная цепная реакция, известная более как ПЦР, не сходит со страниц научных жур­налов с тех пор, как была открыта Кэри Б.Мюллисом в 1983 г., за что он и был удостоен Нобелевской премии в 1993 г. [1]. Часто ПЦР описывают как метод, с помощью которого ученые могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл. «Иглой» является крошечный фрагмент генетиче­ского материала, а ПЦР не только точно обнаруживает этот фрагмент, но и затем, используя естест­венное свойство ДНК — репликацию (размножение), делает его копии.

В основе метода ПЦР лежит уникальное свойство НК (как ДНК, так и РНК) — способность к саморепродукции, которая воспроизводится искусственно in vitro. При этом синтезируются только строго специфические фрагменты НК. В связи с этим, прежде чем проводить ПЦР, необходимо узнать нуклеотидную последовательность искомой НК. После этого синтезируются два коротких ДНК-зонда или праймера, которые комплементарны соответствующим участкам НК-мишени. Прай-мер — самый главный элемент в ПЦР, обеспечивающий запуск и специфичность реакции. Таким об­разом, тест-система для ПЦР состоит из смеси НК испытуемого образца, праймера, дезоксирубонук-леотидов (набора нуклеотидтрифосфатов) и термостабильной ДНК полимеразы (энзима термофиль­ных бактерий Termus aquaticus). Указанную выше реакционную смесь подвергают повторным циклам нагревания/охлаждения для денатурации (при нагревании) НК и гибридизации или отжиге (при ох­лаждении) праймеров с целью синтеза (с помощью ДНК-полимеразы) новых нуклеиновых кислот.

Типичная ПЦР-амплификация состоит в многократном повторении следующих реакций:

  • Денатурация. Первый этап ПЦР состоит в тепловой денатурации образца ДНК выдерживани­ем его при температуре 95 °С в течение 1 мин. Помимо ДНК, в реакционной смеси содержатся в из­бытке 2 праймера, термостабильная ДНК-полимеразаTaq и 4 дезоксирибонуклеотида.
  • Ренатурация. Температуру смеси медленно понижают до 55 °С, при этом праймеры спарива­ются с комплементарными последовательностями ДНК.
  • Синтез. Температуру повышают до 75 °С величины, оптимальной для ДНК-полимеразыTaq. Начинается синтез комплементарной цепи ДНК, инициируемый 3'-гидроксильной группой праймера [2].

Сама полимеразная реакция проходит автоматически в программируемом термостате — термо-циклере (амплификаторе), который может нагревать и охлаждать пробирки с реакционной смесью в очень короткое время. Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии иден­тифицируемого участка матричной НК, повторяется 30-50 раз, в соответствии с заданной програм­мой термоциклера. В первом цикле происходит первое удвоение фрагмента нити НК, ограниченного праймерами, в последующем реакция приобретает каскадный характер (цепная реакция). Это означа­ет, что каждая из нитей служит матрицей для синтеза (полимеризации) нового участка НК, что по­зволяет увеличивать число копий амплифицируемого фрагмента НК в геометрической прогрессии. Течение ПЦР аналогично естественной репликации НК, но при этом строго фиксировано искусствен­но синтезированным праймером. 

Преимущества метода ПЦР

Одним из важнейших критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа является показатель «чувствительности». При этом следует различать аналитическую и диагностиче­скую чувствительность (рис.). Аналитическая чувствительность применительно к ПЦР представляет собой то минимальное количество копий (геномных эквивалентов — г/э) ДНК или РНК в одном мил­лилитре раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Большинство ком­мерческих амплификационных тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую НК, если ее концентрация составляет не менее нескольких сот г/э копий в 1 мл образца. Например, аналитическая чувствительность большинства тест-системы для ВИЧ-1 составляет 300-500 копий ДНК в 1 мл образца.

Относительный предел измерения (аналитическая чувствительность) прямых методов диагностики

Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболевани­ем, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора, и оценива­ется в процентах. В этом аспекте имеется общее положение, определяющее клиническую пригод­ность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем — диагностическая чувствитель­ность метода не должна быть ниже 95-98 %.

Второй универсальный критерий лабораторной эффективности — «специфичность» определяет­ся процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа. Метод ПЦР обладает высочайшей специфичностью, которая достигает 99-100 %.

Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосхо­дят таковые, обеспечиваемые культуральным методом, которые являются «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний. Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущество метода ПЦР стано­вится несомненным. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение даже нескольких не­дель при соблюдении соответствующих температурных норм. Проведенная недавно в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что «быстрые» или экспресс-тесты имеют чувствительность 40-60 %, ИФА — 50-70 %, прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) — 55-75 %, культуральное исследование — 60­80 %, а ПЦР — от 90 до 100 %.

Как видно, ПЦР по сравнению с другими способами обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и непродолжительностью по времени анализа, т.е. «актуальностью» по­лучения результата исследования врачом и пациентом.

Таким образом, приведенные выше факты позволили отметить преимущества ПЦР перед други­ми методами клинической лабораторной диагностики.

  1. Универсальность. Метод принципиально позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно.
  2. Вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалисти­ка, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов. Это обусловливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологи­ческих объектов.
  3. Специфичность. Высокая специфичность (100 %) метода обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент НК (нуклеотидная последовательность), характерный только для данного возбудителя или гена. Таким образом, ПЦР-диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами.
  4. Чувствительность. Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количе­ственной (концентрация) оценки содержания НК. В настоящее время реальный порог чувствительно­сти коммерческих амплификационных тест-систем позволяет определять несколько сот копий в ис­следуемом образце.
  5. Актуальность ответа (быстрота получения результата). Высокая технологичность и авто­матизация метода позволяют получить результаты исследования врачом и пациентом в день проведе­ния анализа.
  6. Возможность доклинической и ретроспективной диагностики. ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме ещё до развития заболевания, например, при инфекциях в инкубационном периоде, т.е. серонегативной фазе или при латентном характере заболе­вания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксированном) материале или биологи­ческих остатках, что важно для идентификации личности или отцовства.
  7. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.
  8. Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или ано­мальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата.
  9. Возможность экспертизы. Полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами.
  10. Исключение возможности инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР, так как ма­териал дезинфицируется лизисом и высокой температурой.

Несмотря на указанные выше достоинства, метод ПЦР все же не лишен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований.

Применение ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний

В настоящее время наиболее быстро развиваются следующие основные направления генодиаг­ностики:

  • диагностика инфекционных заболеваний;
  • диагностика онкологических заболеваний;
  • диагностика генетических заболеваний.

Метод ПЦР решает три главные последовательные задачи:

  • позволяет определять наличие или отсутствие патогена (или аномального гена);
  • в значительной мере отвечает на вопрос «лечить или не лечить?»;
  • позволяет оценить качество терапии путем контроля наличия или отсутствия возбудителя или аномального гена.

За последнее десятилетие методы амплификации нуклеиновых кислот уверенно вошли в лабора­торную практику диагностики урогенитальных инфекций [3-6]. Высокая чувствительность и специ­фичность ПЦР, ставшей для ряда инфекций «золотым стандартом», проверены временем и тщательно апробированы клинически. Необычайная чувствительность метода позволяет специалистам гаранти­рованно обнаруживать единичные возбудители в биологическом материале на основе их генетиче­ской информации. Аналитическая чувствительность АмплиСенс ПЦР-тест-систем для большинства вирусов и бактерий — воспроизводимое выявление 100 микроорганизмов в исследуемой биологиче­ской пробе (1000 микроорганизмов в 1 мл). Специфичность ПЦР при использовании технологии Ам-плиСенс даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100 % [7].

Наиболее эффективно и обоснованно использование метода в урогинекологической практике — для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфек­ции, ВПЧ — вируса папилломы человека; в пульмонологии — для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза; в гастроэнтерологии — для выявления гелико-бактериоза; в клинике инфекционных заболеваний — в качестве экспресс-метода диагностики саль-монеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии — для выявления цитомегалови-русной инфекции, онковирусов. Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению рас­пространения инфекции [8].

Наиболее частой причиной воспалительных заболеваний урогенитального тракта являются хла-мидий и микоплазмы. Chlamidia trachomatis, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis вызывают более половины всех негонококковых урогенитальных заболеваний, передающихся половым путем [9]. Клинические варианты хламидиоза и микоплазмозов разнообразны, чаще всего проявля­ются в виде подострого и вялотекущего уретрита, нередко осложненного простатитом, везикулитом, эпидидимитом у мужчин и эндоцервицитом, вагинитом, аднекситом и бартолинитом — у жен­щин [10]. По данным специалистов ВОЗ, ежегодно у около 50 млн. человек впервые диагностируется генитальный хламидиоз. Экологической нишей хламидийной инфекции является цилиндрический эпителий шейки матки, уретра и прямая кишка. Полагают, что около 10 % всех женщин и мужчин инфицированы Ch. trachomatis. При этом у пациентов хламидиоз протекает бессимптомно. Вместе с тем хламидии могут вызывать тяжелые заболевания, характеризующиеся как хронические воспале­ния малого таза, приводящие к бесплодию (женскому и мужскому) и другим последствиям. Для ди­агностики хламидиозной инфекции используют прямые (культуральные и молекулярно-генетические) и косвенные (определение специфических антител) методы диагностики. Наиболее доступным и эффективным является метод ПЦР.

В последнее время для диагностики заболеваний урогенитального тракта применяется метод ПЦР, позволяющий определять в биологическом материале ДНК Chlamidia trachomatis, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis [11, 12]. Он зарекомендовал себя как метод, который может быть использован в практическом здравоохранении [13].

Так, С.В.Скворцовым (и др.) были изучены возможности ПЦР по выявлению хламидий и мико-плазм при урогенитальной патологии и определению чувствительности ПЦР и РИФ (реакции иму-нофлюоресценции) в диагностике хламидиоза. В таблице 1 приведены результаты обследования больных с негонококковыми воспалительными заболеваниями мочеполовых органов и их половых партнеров.

У мужчин Ch. trachomatis обнаружен в 24,2 % случаев, U. urealyticum — в 21,2 % и M. hominis — в 14,1 %; у женщин — соответственно в 23,3, 36,7 и 20 %. В Карагандинской области с помощью ме­тода ПЦР Ch. trachomatis обнаружен в 9,52 % случаях, U. urealyticum — в 57,89 %, M. hominis — в 27,47 % [14].

Используя ПЦР, удалось установить этиологию заболевания более чем в 60 % случаев. У жен­щин выявлялись чаще, чем у мужчин. Обращает на себя внимание большой процент носительства Ch. trachomatis у контактных лиц, что дает основание для обязательного обследования половых парт­неров. Также были выявлены смешанные инфекции. У женщин смешанные инфекции встречались в 2,5 раза чаще, чем у мужчин.

Диагностика хламидийной, уреаплазменной и микоплазменной инфекций у лиц с заболеваниями урогенитального тракта, %

При параллельном обследовании 86 больных на Ch. trachomatis методами ПЦР и РИФ установ­лено, что ПЦР оказалась более чувствительной: Ch. trachomatis обнаружена у 28 (32,6 %) больных, а с помощью РИФ — у 25 (29,1 %). Результаты исследований свидетельствуют о широких возможно­стях метода ПЦР для объективного комплексного исследования на хламидиоз и микоплазмозы боль­ных с негонококковыми воспалительными заболеваниями мочеполовых органов, высокой эффектив­ности и перспективности его применения в клинической практике [15].

Кроме того, в результате исследований, проведенных В.И.Киселевым (и др.), было установлено, что метод ПЦР может применяться в качестве критерия излеченности при хламидийной инфекции наряду с методом культуры клеток, который должен применяться в качестве подтверждающего теста при положительных результатах ДНК-диагностики [16].

Вирусные гепатиты (ВГ)

Современная таксономия вирусов гепатита человека представлена семью типами возбудителей: А, В, С, D, Е, G и TTV. Для каждого вида возбудителя разработаны амплификационные тест-системы, но наиболее ценным метод ПЦР оказался в диагностике вирусов гепатита В, С, D, G и TTV.

Общие характеристики вирусных гепатитов

Это обусловлено тем, что именно указанные возбудители больше всего ответственны за леталь­ные, хронические и неопластические исходы вирусных гепатитов у людей. В патогенезе ВГ решаю­щую роль играют свойства вируса и генетически детерминированный характер иммунного ответа на этот возбудитель, поэтому не менее важна оценка иммунитета (определение CD-4, CD-8, CD-56 и других фенотипов, уровня интерферонов). Как указывалось выше, наиболее точные оценки иммунно­го статуса получаются при использовании метода проточной цитофлюориметрии. Общая характери­стика вирусных гепатитов приведена в таблице 2.

Вирус простого герпеса I и II типов (ВПГ1+2)

Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых ВПГ 1+2 типов, включает в себя комплекс исследований, состоящий из выявления специфического иммунного ответа (антител), определения вирусной ДНК и вирусных белков (антигенов), а также подтверждение природы патогена культу-ральным методом (по цитопатогенному эффекту вируса в перевиваемой культуре клеток).

Серологические тесты на ВПГ, направленные на выявление антител против ВПГ 1+2, показали низкую диагностическую значимость из-за неоднозначности клинической трактовки. Это обусловле­но тем, что у 97-100 % обследованных клинически здоровых лиц обнаруживались указанные антите­ла. Нарастание титров антител к ВПГ происходит медленно, в течение нескольких недель, при этом могут одновременно определяться специфические антитела класса М и G. Впоследствии антитела к ВПГ класса М могут циркулировать в крови в некоторых случаях от нескольких месяцев до несколь­ких лет. Этот феномен связывают с нарушением иммунитета у инфицированных ВПГ лиц. Кроме то­го, в случае реактивации ВПГ в крови могут вновь появиться специфические антитела класса М. С другой стороны, у иммуноскомпроментированных пациентов при рецидивах инфекции ВПГ анти­тела к вирусу (как IgM, так и IgG) могут не выявляться. Ложноотрицательный ответ на анти-ВПГ класса М может быть у новорождённых. Все перечисленное выше показывает затруднительность дифференцировки острой инфекции ВПГ от её реактивации. Тем не менее серологическое обследо­вание необходимо проводить, и делать это надо методом «парных» сывороток (с интервалом 14-21 день). Так, например, отсутствие в первой и появление во второй сыворотке противогерпетических IgM или нарастание титров специфических IgG в 4 раза и более может быть показателем острой ин­фекции ВПГ. Таким образом, серологические тесты на наличие антител к ВПГ не могут служить единственным и надёжным критерием в постановке клинического диагноза.

Метод ПЦР в настоящее время является основным диагностическим способом в практическом здравоохранении для выявления ДНК вируса. При этом для выделения ДНК ВПГ может быть исполь­зован любой биологический материал: клетки, биологические жидкости, ткани и т.п. В настоящее время разработаны методы количественного определения вирусной ДНК в тестируемом образце. На основании полученных данных можно оценить форму инфекционного процесса. Так, если количест­во ДНК превышает 1000 копий геном-эквивалента (г/э) на 10 лейкоцитов периферической крови, это может свидетельствовать о развитии диссеминированной инфекции.

Цитомегаловирус (ЦМВ)

ЦМВ может быть причиной многих серьёзных заболеваний с летальным исходом. Темпы роста заражения ЦМВ составляют 1 % в год, при этом к пятидесятилетнему возрасту инфицированность людей приближается к 100 % показателю. Эти факты не позволяют однозначно ответить на вопрос о степени патогенности вируса. С одной стороны, ЦМВ редко вызывает клинически манифестные за­болевания у иммунокомпетентных людей. С другой стороны, у иммунодефицитных пациентов отме­чено развитие таких ЦМВ-обусловленных заболеваний, как мононуклеоз (гетерофильнонегативный вариант), хориоретинит, ретардация ментальных функций, глухота и т.п. Как и любая другая герпе­тическая инфекция, при первичном инфицировании ЦМВ возникает пожизненная латенция. Реакти­вация ЦМВ-инфекции зависит от состояния иммунной системы организма, срыв которой приводит к возможности патологического влияния вируса на организм.

Лабораторная диагностика ЦМВ-инфекции включает в себя несколько подходов:

  • выявление инфекционных вирусных частиц или антигенов;
  • определение вирусной ДНК;
  • определение иммунного ответа организма;
  • выявление прямого цитопатического действия вируса, выделенного из биологических суб­стратов пациента, на перевиваемую культуру клеток.

Серологические тесты на ЦМВ являются основными для установления инфицирования данным вирусом. Однако это отнюдь не является основанием для заключения о том, что болезнь действи­тельно вызвана ЦМВ. Показано, что высокие титры анти-ЦМВ-антител обнаружены как у здоровых носителей, так и у больных с острым течением инфекции. Селективное определение специфических антител против ЦМВ класса М и G также не позволяет с полной уверенностью дифференцировать острую инфекцию от реактивации хронической. Поэтому определение вирусных антигенов и ДНК ЦМВ становится важным тестом для диагностики заболевания этим вирусом.

Метод ПЦР широко используется для диагностики ЦМВ в любых биологических тканях и жид­костях, в том числе и биопсийном материале, фиксированном формалином. Этот метод превышает по своей чувствительности все имеющиеся аналоги. Для увеличения диагностической и прогностиче­ской значимости разрабатываются количественные методы исследования, создаются праймеры к сверхранним, ранним и поздним генам вируса. Кроме того, апробируются новые технологии ПЦР, основанные на определении РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Это позволит выявлять мРНК репли­цирующегося ЦМВ. Во многих работах показано, что прямая детекция ДНК ЦМВ в плазме методом ПЦР коррелирует с повышенным риском развития манифестной формы ЦМВ или связанными с ней осложнениями. Кроме того, определение вирусной нагрузки ЦМВ в крови позволяет оценить эффек­тивность противовирусной терапии [17].

Папилломавирусная инфекция человека

Согласно пресс-релизу Всемирной организации здравоохранения от 03.06.96 г. во всем мире от­мечается рост заболеваемости папилломавирусными инфекциями (HPV — от англ. Human Papilloma­viruses Установлено, что ВПЧ-инфекция — высокораспространенное заболевание, передаваемое по­ловым путем. Обширные эпидемиологические исследования проводятся в разных странах [18-20].

Согласно данным эпидемиологических исследований встречаемость ВПЧ значительно варьирует в различных этнико-географических регионах. Распространенность ВПЧ во многом определяется соци­ально-экономическими, поведенческими, медико-гигиеническими условиями. Минимальная зареги­стрированная частота инфицированности ВПЧ (5 %) наблюдается в Испании. Эта страна принадле­жит к странам с «низким» риском заболевания раком шейки матки. Наибольший уровень инфициро­вания наблюдается в Аргентине и Гондурасе и приближается к 40 % от всего обследованного контин­гента.

HPV-инфекцию начали интенсивно изучать после установления доказательств роли данного ви­руса в возникновении опухолей аногенитальной области, в частности, рака шейки матки.

HPV — мелкие ДНК-вирусы, особенностью которых является пролиферативное влияние на эпи-телиоциты кожи и наружных слизистых. В настоящее время известно около 100 типов HPV, разли­чаемых онкогенными свойствами. К группе высокого онкопотенциала относят следующие типы ви­русов папилломы: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68. К типам с низкими предиктами онко-генности относят варианты: 6, 11, 42, 43 и 44. Что же касается частоты встречаемости типов ВПЧ, то среди здоровых женщин наиболее часто встречается ВПЧ типа 16, в 1,5-2 раза реже выявляется ВПЧ типа 18. Суммарно на долю этих двух типов приходится 45 % от общего числа выявляемых типов ВПЧ. В лабораторной диагностике НРV-инфекции применяются исключительно молекулярно-генетические методы анализа. Использование метода ПЦР для выявления папилломатоза резко по­вышает уровень доклинической диагностики предраковых состояний благодаря высочайшей чувст­вительности и предсказательной ценности типирования вируса. Проведенные эпидемиологические исследования в Европе и Северной Америке показали, что при всех формах инвазивного рака матки у 70 % женщин старше 35 лет с дисплазией клеток эпителия матки был выявлен вирус папилломы пре­имущественно 16 и 18 типов. У женщин с нормальной цитологией НРV обнаруживался только в 3,5 % обследованных [21].

Применение ПЦР для диагностики наследственных заболеваний

В патогенезе наследственных болезней лежат аномалии наследственного аппарата (генома) клет­ки. Данные повреждения могут затрагивать весь геном или только отдельные хромосомы клетки. В свя­зи с этим могут возникать хромосомные или генные болезни. По данным генетического мониторинга в странах Восточной Европы нарушения генома разной степени встречаются у 1,5-2 % всех новорож­денных, что влияет на показатели здоровья детского населения. Методы молекулярной диагностики в своей сути явились продуктом исследований в области устройства генома клетки человека [22].

В настоящее время ПЦР является основным диагностическим средством в клинической практике генетика. С помощью ПЦР можно определять локализацию предполагаемых мутаций или полиморф­ных сайтов в ДНК клетки. Разработаны и практически применяются варианты автоматического поис­ка последовательностей ДНК, использование которых оптимизирует амплификацию необходимого участка ДНК. В качестве источника матричной ДНК может использоваться любой биологический материал (даже деструктурированный), сохранивший в своем составе определённую часть нуклео-тидной последовательности. Существует множество модификаций ПЦР для медико-генетического анализа, применение которых зависит от целей и характера исследований. Самым главным достоин­ством ПЦР для медико-генетической диагностики является универсальность, позволяющая прово­дить исследования на любой стадии онтогенеза индивидуума, в том числе и в пренатальном периоде. В диагностике генетических болезней имеют место два подхода:

  • прямая диагностика, основанная на непосредственной идентификации мутации в определён­ном гене;
  • косвенная (непрямая) диагностика, основанная на маркировании мутантного гена с помощью молекулярных маркеров.

Прямая диагностика основана на определении мутации в самом гене. Этим создается высокая точность исследования (98-100 %) и возможность пренатальной диагностики в семье и выявления гетерозиготных носителей при отсутствии больного ребёнка. Непрямой, или косвенный, подход яв­ляется более универсальным и распространённым. Его суть лежит в анализе внутри- и внегенных по­лиморфных сайтов. Главное достоинство косвенного метода — возможность ДНК-диагностики без точной идентификации мутации в самом гене, даже при отсутствии данных о точной идентификации мутантного гена. Недостатком этого метода является необходимость наличия в семье больного ре­бёнка или возможность исследования «архивной» ДНК в случае его гибели. Кроме того, имеется более высокий процент ошибки, обусловленный переносом полиморфного сайта на здоровый аллель вследствие кроссинговера.

В настоящее время можно осуществлять пренатальную клиническую диагностику методом ПЦР следующих моногенных заболеваний: гемофилия А и В, миодистрофия Дюшена/Беккера, болезни Хантера и Леш-Нихана, агаммаглобулинемия, муковисцидоз, фенилкетонурия, синдромы Альпорта и Шарко-Мари-Тус, болезнь Коновалова-Вильсона и дефицит альфа-1-антитрепсина и т.п. [23-24].

Применение ПЦР для диагностики онкологических заболеваний

Онкологическая заболеваемость является одной из основных причин смертности, особенно сре­ди населения стран СНГ, подвергшихся воздействию последствий Чернобыльской катастрофы, — государств с высоким возрастным цензом населения. Концептуальное положение «опухоль — это патология генов» во многом определило стратегию диагностики и лечения новообразований. Опре­деление понятий «канцероген», «протоонкоген» и «антионкоген», в сочетании с открытием и внедре­нием в клиническую практику метода ПЦР, послужило решительным толчком в области диагностики и лечения новообразований. Тестирование молекулярно-генетических онкомаркеров предполагает выявление дефектов структуры и функциональную активность НК протоонкогенов, антионкогенов и биологических канцерогенов (вирусов). Наиболее приемлемым способом точно и быстро определять аномальные ДНК является ПЦР. Высокая чувствительность метода позволяет определять аномаль­ную ДНК в ничтожно малых количествах (десятки, сотни копий агента), что означает выявление не­опластических клеток на доклинической стадии опухолевого процесса.

Теоретической предпосылкой генодиагностики рака является то обстоятельство, что канцероге­нез есть результат накопления в соматических клетках мутаций ряда функционально важных генов, участвующих в клеточной пролиферации, апоптозе, репарации ДНК и др. В силу этого обнаружение в биологических средах организма мутантных генов (т.е. специфическим образом измененных нук-леотидных последовательностей ДНК) свидетельствует о присутствии в организме трансформиро­ванных клеток. За последнее десятилетие было выявлено более сотни генов, ответственных за гене­зис различных онкозаболеваний; мутации в этих генах идентифицированы, а генетические пути, в рамках которых эти гены действуют, охарактеризованы [25]. Общепризнано, что от 3 до 8 последова­тельных генетических повреждений в делящейся соматической клетке могут привести к ее озлокаче-ствлению и к запуску процесса образования опухоли [26].

В соответствии с двумя типами дефектов, лежащих в основе канцерогенеза, известные сегодня ДНК-маркеры являются либо генетическими, сопряженными с изменением нуклеотидной последова­тельности ДНК, либо эпигенетическими, обусловленными аберрантным метилированием определен­ных последовательностей ДНК. Обнаружение в биологических средах таких специфическим образом измененных или модифицированных последовательностей указывает на присутствие в организме опухоли.

К генетическим дефектам относятся мутации, делеции и вставки, которые могут быть локализо­ваны как в ядерной, так и в митохондриальной ДНК, в составе как структурных генов, так и некоди-рующих микросателлитных последовательностей. Наиболее частым объектом анализа являются так­же мутации онкогенов (например, К-RAS) или генов-супрессоров опухолевого роста (в частности, ТР53, АРС и др.).

К эпигенетическим изменениям относится метилирование остатков цитозина в регуляторных участках генов-супрессоров. Являясь важным физиологическим процессом, лежащим, в частности, в основе феномена генетического импринтинга, метилирование ДНК становится существенным факто­ром канцерогенеза в том случае, когда оно распространяется за пределы четко определенных генети­ческих «территорий».

Опухолевые клетки и содержащиеся в них ДНК можно выявлять на удалении от основного оча­га. При обнаружении специфических мутаций в ДНК естественных выделений можно подозревать опухоль соответствующего органа. Этот подход весьма эффективен в случае опухолей мочевого пу­зыря, толстой кишки, легких и бронхов, поджелудочной железы [27].

Основные направления использования ПЦР в онкологической патологии включают:

  • ДНК-диагностику наследственных форм рака;
  • ДНК-диагностику спорадических форм рака;
  • определение микрометастазов;
  • ДНК-диагностику биологических канцерогенов (HPV 16 и 18 типов, ВЭБ-инфекции,HBV и HCV, ретровирусы и т.п.);
  • доклиническую диагностику опухолей (определения протоонкогенов и антионкогенов);
  • прогноз заболевания и успешности назначаемой терапии, а также эффективность проведенного лечения на основе диагностики функциональной активности онкогенов;
  • исследование «архивных» биоптатов с установленным клинико-гистологическим диагнозом. Это важно в оценке диагностической значимости предполагаемого маркера и правильности те­рапии.

Использование метода ПЦР в практической онкологии даст ценную научную и клиническую информацию врачу, что значительно улучшит качество диагностики.

Персонализированная медицина

Иногда лекарства оказываются токсичными или аллергенными для некоторых пациентов. При­чины этого отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенный цитохром (белок печени, отвечающий за метаболизм чужеродных веществ) может быть более активен, у другого — менее. Для того чтобы определить, какой разновидностью цитохро-ма обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства. Та­кой анализ называют предварительным генотипированием (англ. prospective genotyping) [28].

 

 

Список литературы

  1. ФедоровН.А. Генодиагностика инфекции методом ПЦР // Педиатрия. — 1995. — № 4. — С. 69-70.
  2. ГликБ., ПастернакДж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — М.: Мир, 2002. — 589 с.
  3. medlab.scn.ru
  4. Жданов А.В., Малинина Э.В., Файзуллин Л.З. и др. Выявление хламидий методом полимеразной цепной реакции при патологиях репродуктивной системы мужчин и женщин // Бюллетень экспериментальной биологии. — 1996. — № 5. —С. 547-550.
  5. Тихонова Л.И. Общий обзор ситуации с инфекциями, передаваемыми половым путем // Современные методы диаг­ностики, терапии и профилактики инфекций, передаваемых половым путем, и других урогенитальных инфекций: Материа­лы рабочего совещания дерматовенерологов и акушеров-гинекологов. — М., 1999. — С. 2-3.
  6. Black C.M. Current methods of laboratory diagnoses of Clamydia trachomatis infections // Clin. Microbiol Rev. — 1997. —№ 10. — Р. 160-184.
  7. med-expert.ru
  8. medsan.ru
  9. Овчинников Н.М., Беднова В.Б., Делекторский В.В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. — М.: Медицина, 1987. — 273c.
  10. Ракольская И.В., Вульфович Ю.В. Урогенитальные микоплазмозы: Обзорная информация. — М., 1990. — 437 с.
  11. Bauwens J.E., ClarkM., Stamm W.E. Diagnosis of Chlamydia Trachomatis endocervical infections by a commercial polymerase chain reaction assay // Clinical microbiology. — 1993. — Vol. 31. — № 11. — P. 3023-3027.
  12. Blanchard A. et al. Detection of Ureaplasma urealyticum by polymerase chain reaction in the urogenital tract of adult, amniotic fluid and in the respiratory tract // Clinical infectional diseases. — 1993. — Vol. 17. — № 8. — P. 148-153.
  13. Jaschek G., Gaydos C.A., Welsh L.E., Quinn T.S. Direct detection of Clamydia trachomatis in urine speciments from symptomatic and asymptomatic men by using a rapid polymerase chain reaction assay // Clinical microbiology. — 1993. — Vol. 31.№ 5. — Р. 1209-1212.
  14. Погосян Г.П., Ли К.Г., Жумина А.Г. Изучение амплификации ДНК некоторых бактериальных агентов, вызывающих урогенитальные заболевания // Повышение качества образования и научных исследований: Материалы междунар. науч.-практ. конф. в рамкахVI Сатпаевских чтений (12-14 апреля 2007 г.). — Экибастуз: Изд-во ЕИТИ, 2007. — С. 744-749.
  15. Скворцов С.В., Найденов Ю.Н. и др. Диагностика хламидиоза и урогенитальных микоплазмозов при помощи цепной полимеразной реакции // Военно-медицинский журнал. — 1995. — № 7. — С. 49-50.
  16. КиселевВ.И., ЛатыповаМ.Ф. и др. Полимеразная цепная реакция в качестве критерия излеченности урогенитально-го хламидиоза // Вестник дерматологии и венерологии. — 2001. — № 4. — С. 4-5.
  17. dialab.dp.ua
  18. Boone C.W., Kelloff G.J. Endpoint markers for clinical trails of chemopreventive agents derived from the properties of epithelial precancer measured by computer-assisted image analysis // Cancer Survey. — 1998. — 32. — P. 133-147.
  19. McCree D.H. et al. National survey by specialty of US physicians' HPV screening practices // Prevmed. — 20 — № 36.
  20. Р. 159-163.
  21. Sherman M.E., Lorinoz A.T., ScotD.R. et al. Baseline cytology, human papillomavirus testing and risk for cervical neoplasia: a 10-year cohort analysis // Natl. Cancer Inst. — 2003. — № 95. — Р. 46-52.
  22. Кубанов А.А. Современные методы диагностики вируса папилломы человека // Вестник дерматологии и венероло­гии. — 2005. — № 1. —C. 26-35.
  23. Баев А.А. Программа «Геном человека», ее возникновение, содержание и развитие // Итоги науки и техники: геном человека. — 1990. — Т. 1. — С. 4-33.
  24. Баранов В.С. Ранняя диагностика наследственных болезней в России (современное состояние и перспективы) // Ме­ждународные медобзоры. — 1994. — Т. 2. — № 4. — С. 236-243.
  25. БарановВ.С., Гинтер Е.К. Генетические аспекты муковисцидоза. — М.: Медицина, 1995. — 90 с.
  26. Ланцов В.А., Вострюхина О.А. Диагностика злокачественных опухолей толстой кишки с помощью молекулярно-генетического анализа фекальной ДНК // Вопросы онкологии. — 2005. — Т. 51. — № 2. — С. 167-172.
  27. de Kok T.M., van Maanen J.M. Evaluation of fecal mutagenicity and colorectal cancer risk// Mutat Res. — 2000. —— Р. 53-101.
  28. Golijow C.D., Mouron S.A. et al. Differences in K-ras codon 12 mutation frequency between «high risk» and «low-risk» HPV-infected samples// Gynecol. Oncology. — 1999. — 75. — Р. 108-112.org.ru.
Год: 2011
Город: Караганда
Категория: Медицина
loading...