Другие статьи

Цель нашей работы - изучение аминокислотного и минерального состава травы чертополоха поникшего
2010

Слово «этика» произошло от греческого «ethos», что в переводе означает обычай, нрав. Нравы и обычаи наших предков и составляли их нравственность, общепринятые нормы поведения.
2010

Артериальная гипертензия (АГ) является важнейшей медико-социальной проблемой. У 30% взрослого населения развитых стран мира определяется повышенный уровень артериального давления (АД) и у 12-15 % - наблюдается стойкая артериальная гипертензия
2010

Целью нашего исследования явилось определение эффективности применения препарата «Гинолакт» для лечения ВД у беременных.
2010

Целью нашего исследования явилось изучение эффективности и безопасности препарата лазолван 30мг у амбулаторных больных с ХОБЛ.
2010

Деформирующий остеоартроз (ДОА) в настоящее время является наиболее распространенным дегенеративно-дистрофическим заболеванием суставов, которым страдают не менее 20% населения земного шара.
2010

Целью работы явилась оценка анальгетической эффективности препарата Кетанов (кеторолак трометамин), у хирургических больных в послеоперационном периоде и возможности уменьшения использования наркотических анальгетиков.
2010

Для более объективного подтверждения мембранно-стабилизирующего влияния карбамезапина и ламиктала нами оценивались перекисная и механическая стойкости эритроцитов у больных эпилепсией
2010

Нами было проведено клинико-нейропсихологическое обследование 250 больных с ХИСФ (работающих в фосфорном производстве Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции)
2010


C использованием разработанных алгоритмов и моделей был произведен анализ ситуации в системе здравоохранения биогеохимической провинции. Рассчитаны интегрированные показатели здоровья
2010

Специфические особенности Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции связаны с производством фосфорных минеральных удобрений.
2010

Разработка диагностической тест-системы для выявления Mycoplasma hominis — условно-патогенного возбудителя инфекций урогенитального тракта методом ПЦР в режиме реального времени

Разработана отечественная диагностическая тест-система для выявления Mycoplasma hominis методом ПЦР в режиме реального времени. Подобраны праймеры и меченые зонды, проведены амплификация и клонирование целевых участков генома возбудителя с целью создания рекомбинантного положи­тельного контроля, созданы оптимальные условия проведения ПЦР и концентрации основных компо­нентов реакционной смеси. Определена эффективность ПЦР и сравнение разработанной тест-системы для выявления Mycoplasma hominis в режиме реального времени с коммерческими наборами.

Введение

За последние годы резко возросло число случаев заболеваний, вызванных инфекциями, пере­дающимися половым путем (ИППП). Наблюдается неуклонный рост ИППП у лиц молодого возраста, женщин фертильного возраста, которые часто сопровождаются осложнениями, приводящими к утра­те трудоспособности, бесплодию, внутриутробной инфекции, обусловливая заболевания плода и но­ворожденного [1].

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) каждый день во всем мире около одного миллиона человек заражаются инфекциями, передаваемыми половым путем. Учитывая этот факт, ВОЗ утвердила глобальную стратегию на 2005-2015 гг. «Предотвращение и контроль инфек­ций, передаваемых половым путем».

В комплексной программе «Здоровый образ жизни» на 2008-2016 годы, разработанной в целях реализации долгосрочной стратегии «Казахстан-2030» и утвержденной Постановлением Правитель­ства Республики Казахстан от 21 декабря 2007 г., важным направлением являются вопросы противо­стояния эпидемии инфекций, которые передаются половым путем, ВИЧ и СПИДу [2].

В последнее десятилетие проблема генитальной инфекции находится в центре внимания многих исследователей. Возрастающее клиническое значение приобретают условно-патогенные микроорга­низмы микробиоты урогенитального тракта, такие как Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans и др. [3, 4].

Роль микоплазм в патологии урогенитального тракта до настоящего времени остается не вполне ясной. В значительной мере это обусловлено свойствами микроорганизмов, которые относятся к классическим внутриклеточным паразитам. Микоплазмы не имеют клеточной стенки, их хромосома состоит примерно из 500 генов, что в несколько раз меньше стандартного прокариотического генома. Активная репродукция микоплазм возможна лишь при использовании клеточных ресурсов клетки-хозяина, что и определяет внутриклеточный способ существования возбудителя. В связи с этим для лабораторной диагностики микоплазм не всегда приемлемы традиционные методы, такие как микро­скопия или культуральная диагностика. В последние годы были разработаны методы ДНК диагно­стики с использованием ДНК-зондов или полимеразной цепной реакции (ПЦР) для представителей семейства микоплазм [5-7].

Диагностическая ценность ПЦР признана во всем мире. С каждым годом растет число лабора­торий, использующих этот метод для диагностики инфекционных заболеваний. Для качественной характеристики и количественной оценки микрофлоры урогенитального тракта перспективным явля­ется метод ПЦР в реальном времени, который позволяет избежать ошибки в диагностике и лечении. Проведенные сравнительные исследования показали, что полимеразная цепная реакция является бо­лее чувствительным, быстрым и более дешевым диагностическим тестом для диагностики наличия микоплазм, чем культуральное исследование (бактериологический посев) [5, 8-10].

Опубликованная ранее [10, 11] суммированная оценка чувствительности различных методов ди­агностики показала, что экспресс-тесты имеют чувствительность 40-60 %, ИФА — 50-70, ПИФ — 55-75, культуральное исследование — 60-80, а ПЦР — 90-100 %. Диагностическая специфичность ПЦР тест-систем, определяемая процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные ре­зультаты анализа, также достаточно высокая и оценивается в 99-100 %.

Таким образом, целью настоящей работы является разработка отечественной диагностической тест-системы для выявления Mycoplasma hominis методом ПЦР в режиме реального времени.

Материалы и методы

Материалом для исследования служили соскобы эпителиальных клеток из уретры у мужчин и из цервикального канала у женщин. Урогенитальные образцы, полученные от пациентов с воспалитель­ными заболеваниями органов репродуктивной системы, использовали для оценки чувствительности и специфичности обнаружения Mycoplasma hominis, а также для сравнения с коммерческой ПЦР-диагностической тест-системой «АмплиСенс Mycoplasma hominis» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотреб-надзора, РФ).

Для выявления ДНК возбудителя использовался ДНК-сорбционный метод (ФГУН ЦНИИЭ, РФ), основанный на специфической обратимой сорбции ДНК в присутствии хаотропных солей (гуанидин-тиоцианат, гуанидинхлорид) на частицы силикагеля.

Амплификацию фрагмента ДНК-мишени fts Y проводили методом TaqMan ПЦР в режиме реаль­ного времени с использованием специфичных праймеров F- (5'-ATT GAT TGC TGC AGG TGA TAC A-3'), R- (5'-GGT GTT ACA ATA TCA GCC CCA AC-3') и зонда (5' R6G-AGA GCA GCG GCA GTT GAA - BHQ2 3'). Объем реакционной смеси 25 мкл включает образец ДНК 5 мкл, 20 мкл MasterMix Qiagen (10 qmol/L каждого праймера и зонда). Температурный профиль реакции: 50 °С 2 мин, 95 °С 15 мин, 45 циклов (95 °С 30 с и 60 °С 60 с) [12].

В процессе оптимизации различных вариантов ПЦР подбирали температурный режим, число и продолжительность циклов амплификации, соотношение зондов и праймеров, концентрацию MgCl2, обеспечивающие максимальную чувствительность и специфичность обнаружения ДНК Mycoplasma hominis.

С целью получения рекомбинантного положительного контроля продукты амплификации кло­нировали с использованием набора Promega pGEM-T Easy в плазмиду pGEM-T. Полученные лигаз-ные смеси использовали для последующей химической трансформации компетентных клеток Escherichia coli. Отбор колоний, содержащих целевой фрагмент, проведен методом сине-белой се­лекции. Отобранные клоны перенесены в жидкую среду LB и инкубированы при 37 °С в течение 16 часов. Из полученных культур выделены плазмиды с применением метода щелочного лизиса. Нук-леотидная последовательность целевых фрагментов, клонированных в плазмиды, определена методом секвенирования с использованием универсальных праймеров М13Ғ (5-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3) и M13R (5-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3).

Проверку на наличие неспецифической гомологии в нуклеотидной последовательности плазми-ды проводили с использованием поисковой системы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/, NCBI).

Результаты и обсуждение

Проведена оптимизация условий амплификации при выявлении возбудителя воспалительных за­болеваний урогенитального тракта Mycoplasma hominis на стандартных и клинических образцах ме­тодом ПЦР в режиме реального времени.

Экспериментальным путем подобраны температурный режим ПЦР и оптимальные концент­рации основных компонентов реакционной смеси, оказывающих значительное влияние на чувстви­тельность и специфичность реакции, так как при снижении температуры отжига ниже оптимальной и при повышении концентрации праймеров и MgCl2 выше оптимальных неспецифичность ПЦР-амплификации повышается, а при повышении температуры отжига выше оптимальной снижается выход специфической амплифицируемой ДНК, вплоть до ее полного исчезновения. Для фрагментов ДНК размером 100 н.п. и меньше требуется уменьшение концентрации дезоксинуклеотидтрифосфа-тов (dNTPs) для повышения эффективности реакции. Фрагменты ДНК Mycoplasma hominis имеют длину 67 н.п.

В таблицах 1-2 представлены подобранные оптимальные условия проведения ПЦР в режиме ре­ального времени и концентрации основных компонентов в реакционной смеси.

Программа амплификации 

Состав реакционной смеси

Исследована аналитическая чувствительность реакции путем тестирования серии последова­тельных разведений плазмидного стандарта, несущего клонированные фрагменты ДНК-мишени Mycoplasma hominis белка fts Y и последующим построением калибровочного графика зависимости порогового цикла от исходной концентрации матриц с определением коэффициента корреляции.

Зависимость значений порогового цикла от логарифма начального числа копий плазмид линей­ная в диапазоне от 50 до 50 млн. копий.

На рисунке 1 представлены результаты определения чувствительности ПЦР при выявлении воз­будителя урогенитальных инфекций Mycoplasma hominis.

Таким образом, выявлены высокая эффективность амплификации (Е = 1,00), рассчитанная на основании крутизны калибровочной прямой, построенной через экспериментальные точки в полуло­гарифмической системе координат, и сильная корреляционная связь (R2 в пределах 0,999) концентра­ции калибровочных образцов ДНК и определяемого значения порогового цикла. Также с большой точностью совпадает количество заданных копий стандарта с фактическим значением, что говорит о достоверности результатов.

В результате разработанная тест-система позволяет с высокой точностью детектировать низкие концентрации ДНК Mycoplasma hominis, что составляет не менее 50 копий в образце, и может быть использована для количественного определения ДНК в анализируемых образцах.

Аналитическую специфичность реакции оценивали на образцах ДНК следующих видов микро­организмов: Ureaplasma spp. (U.parvum/U.urealyticum), Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Gardnerella vaginalis, Candida al­bicans, Herpes simplex virus 1,2. В результате тестирования выяснилось, что неспецифические реакции по данным видам возбудителей отсутствовали.


Для оценки диагностической эффективности проведено сравнение результатов амплификации ПЦР в режиме реального времени разработанной тест-системы для выявления Mycoplasma hominis с российскими коммерческими наборами реагентов «АмплиСенс» производства ФГУН «ЦНИИ эпиде­миологии» Роспотребнадзора, которые имеют государственные регистрационные удостоверения Ми­нистерства здравоохранения РФ и разрешены к использованию в клинической лабораторной диагно­стике.

Определение числа копий Mycoplasma hominis 

Рисунок 1. Определение числа копий Mycoplasma hominis

Результаты амплификации ДНК возбудителя Mycoplasma hominis с гибридизационно-флуорес-центной детекцией в режиме реального времени представлены на рисунке 2.

Результаты амплификации Mycoplasma hominis: а — набор реагентов «АмплиСенс»; б — разработанная тест-система 

Сравнение результатов амплификации показало, что кривые флуоресценции, пересекающие по­роговую линию на стадии характерного экспоненциального нарастания флуоресцентного сигнала, в обоих случаях мало отличаются друг от друга, что доказывает пригодность разработанных нами ПЦР тест-систем в режиме реального времени по выявлению Mycoplasma hominis для применения в диаг­ностике возбудителей урогенитальных инфекций.

 

 

Список литературы

  1. Аскарова Г.К., Маутканов М.Р., Утегенова А.К. Оценка диагностических и прогностических факторов, влияющих на течение и исход беременности // Актуальные вопросы эпидемиологии, клиники, диагностики, профилактики и терапии со­циально-значимых дерматозов и инфекций, передаваемых половым путем: Тез. докл. наIV Междунар. конф., 4-5 октября 2007. — Алматы: Білім, — С. 122-123.
  2. Национальный доклад о ходе работы для ССГАООН: Республика Казахстан (январь 2008 г. - декабрь 2009 г.). — 2010. — 23 с.
  3. Гомберг М.А. Бактериальный вагиноз и новые инфекции, с ним ассоциированные // Российский вестник акушера-гинеколога. — 2010. — № 2.
  4. Руководство «Инфекции, передаваемые половым путем» // Институт здоровья семьи. — 2009. — 168 с.
  5. Shmuel Razin. DNA probes and PCR in diagnosis of mycoplasma infections // Molecular and Cellular Probes. — 1994. — № 8. — Р. 497-511.
  6. Киселев В.И., Дмитриев Г.А., Латыпова М.Ф. Полимеразная цепная реакция в диагностике урогенитальных инфек­ций: Пособие для врачей. — М.: Медицина, 2000. — 16 с.
  7. Карамова А.Э., Поляков А.В., Хамаганова И.В. ЗначениеUreaplasmaurealyticumиMycoplasmagenitaliumкак возбу­дителей воспалительных заболеваний урогенитального тракта // Клиническая микробиология и антимикробная химиотера­пия. — 2004. — Т. 6. — № 4. — С. 365-370.
  8. Abele-Horn M., Wolff C. et al. Polymerase chain reaction versus culture for detection of Ureaplasma urealyticum and My­coplasma hominis in the urogenital tract of adults and the respiratory tract of newborns // J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. — 1996. — № 15(7). — 595.
  9. Petrikkos GL., Hadjisoteriou M., Daikos GL. PCR versus culture in the detection of vaginal Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis // Int. J. Gynaecol. Obstet. — 2007. — № 97(3). — 202. 
  10. Дмитриев Г.А. Современные методы диагностики наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путем // ConsiliumMedicum. — 2002. — № 5. — С. 256-259.
  11. Щербо С.Н. Успехи в диагностике инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции // Медицин­ская картотека. — М.: Медицина, 2002. — 22 с.
  12. Jean Pierre Menard, Florence Fenollar et al. Molecular Quantification of Gardnerella vaginalis and Atopobium vaginae Loads to Predict Bacterial Vaginosis // Clinical Infectious Diseases. — 200 — № 47. — Р. 33-13.

Разделы знаний

Архитектура

Научные статьи по Архитектуре

Биология

Научные статьи по биологии 

Военное дело

Научные статьи по военному делу

Востоковедение

Научные статьи по востоковедению

География

Научные статьи по географии

Журналистика

Научные статьи по журналистике

Инженерное дело

Научные статьи по инженерному делу

Информатика

Научные статьи по информатике

История

Научные статьи по истории, историографии, источниковедению, международным отношениям и пр.

Культурология

Научные статьи по культурологии

Литература

Литература. Литературоведение. Анализ произведений русской, казахской и зарубежной литературы. В данном разделе вы можете найти анализ рассказов Мухтара Ауэзова, описание творческой деятельности Уильяма Шекспира, анализ взглядов исследователей детского фольклора.  

Математика

Научные статьи о математике

Медицина

Научные статьи о медицине Казахстана

Международные отношения

Научные статьи посвященные международным отношениям

Педагогика

Научные статьи по педагогике, воспитанию, образованию

Политика

Научные статьи посвященные политике

Политология

Научные статьи по дисциплине Политология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Психология

В разделе "Психология" вы найдете публикации, статьи и доклады по научной и практической психологии, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. В своих работах авторы делают обзоры теорий различных психологических направлений и школ, описывают результаты исследований, приводят примеры методик и техник диагностики, а также дают свои рекомендации в различных вопросах психологии человека. Этот раздел подойдет для тех, кто интересуется последними исследованиями в области научной психологии. Здесь вы найдете материалы по психологии личности, психологии разивития, социальной и возрастной психологии и другим отраслям психологии.  

Религиоведение

Научные статьи по дисциплине Религиоведение опубликованные в Казахстанских научных журналах

Сельское хозяйство

Научные статьи по дисциплине Сельское хозяйство опубликованные в Казахстанских научных журналах

Социология

Научные статьи по дисциплине Социология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Технические науки

Научные статьи по техническим наукам опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физика

Научные статьи по дисциплине Физика опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физическая культура

Научные статьи по дисциплине Физическая культура опубликованные в Казахстанских научных журналах

Филология

Научные статьи по дисциплине Филология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Философия

Научные статьи по дисциплине Философия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Химия

Научные статьи по дисциплине Химия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Экология

Данный раздел посвящен экологии человека. Здесь вы найдете статьи и доклады об экологических проблемах в Казахстане, охране природы и защите окружающей среды, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. Авторы рассматривают такие вопросы экологии, как последствия испытаний на Чернобыльском и Семипалатинском полигонах, "зеленая экономика", экологическая безопасность продуктов питания, питьевая вода и природные ресурсы Казахстана. Раздел будет полезен тем, кто интересуется современным состоянием экологии Казахстана, а также последними разработками ученых в данном направлении науки.  

Экономика

Научные статьи по экономике, менеджменту, маркетингу, бухгалтерскому учету, аудиту, оценке недвижимости и пр.

Этнология

Научные статьи по Этнологии опубликованные в Казахстане

Юриспруденция

Раздел посвящен государству и праву, юридической науке, современным проблемам международного права, обзору действующих законов Республики Казахстан Здесь опубликованы статьи из научных журналов и сборников по следующим темам: международное право, государственное право, уголовное право, гражданское право, а также основные тенденции развития национальной правовой системы.