Разработка диагностической тест-системы для выявления Mycoplasma hominis — условно-патогенного возбудителя инфекций урогенитального тракта методом ПЦР в режиме реального времени

Разработана отечественная диагностическая тест-система для выявления Mycoplasma hominis методом ПЦР в режиме реального времени. Подобраны праймеры и меченые зонды, проведены амплификация и клонирование целевых участков генома возбудителя с целью создания рекомбинантного положи­тельного контроля, созданы оптимальные условия проведения ПЦР и концентрации основных компо­нентов реакционной смеси. Определена эффективность ПЦР и сравнение разработанной тест-системы для выявления Mycoplasma hominis в режиме реального времени с коммерческими наборами.

Введение

За последние годы резко возросло число случаев заболеваний, вызванных инфекциями, пере­дающимися половым путем (ИППП). Наблюдается неуклонный рост ИППП у лиц молодого возраста, женщин фертильного возраста, которые часто сопровождаются осложнениями, приводящими к утра­те трудоспособности, бесплодию, внутриутробной инфекции, обусловливая заболевания плода и но­ворожденного [1].

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) каждый день во всем мире около одного миллиона человек заражаются инфекциями, передаваемыми половым путем. Учитывая этот факт, ВОЗ утвердила глобальную стратегию на 2005-2015 гг. «Предотвращение и контроль инфек­ций, передаваемых половым путем».

В комплексной программе «Здоровый образ жизни» на 2008-2016 годы, разработанной в целях реализации долгосрочной стратегии «Казахстан-2030» и утвержденной Постановлением Правитель­ства Республики Казахстан от 21 декабря 2007 г., важным направлением являются вопросы противо­стояния эпидемии инфекций, которые передаются половым путем, ВИЧ и СПИДу [2].

В последнее десятилетие проблема генитальной инфекции находится в центре внимания многих исследователей. Возрастающее клиническое значение приобретают условно-патогенные микроорга­низмы микробиоты урогенитального тракта, такие как Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans и др. [3, 4].

Роль микоплазм в патологии урогенитального тракта до настоящего времени остается не вполне ясной. В значительной мере это обусловлено свойствами микроорганизмов, которые относятся к классическим внутриклеточным паразитам. Микоплазмы не имеют клеточной стенки, их хромосома состоит примерно из 500 генов, что в несколько раз меньше стандартного прокариотического генома. Активная репродукция микоплазм возможна лишь при использовании клеточных ресурсов клетки-хозяина, что и определяет внутриклеточный способ существования возбудителя. В связи с этим для лабораторной диагностики микоплазм не всегда приемлемы традиционные методы, такие как микро­скопия или культуральная диагностика. В последние годы были разработаны методы ДНК диагно­стики с использованием ДНК-зондов или полимеразной цепной реакции (ПЦР) для представителей семейства микоплазм [5-7].

Диагностическая ценность ПЦР признана во всем мире. С каждым годом растет число лабора­торий, использующих этот метод для диагностики инфекционных заболеваний. Для качественной характеристики и количественной оценки микрофлоры урогенитального тракта перспективным явля­ется метод ПЦР в реальном времени, который позволяет избежать ошибки в диагностике и лечении. Проведенные сравнительные исследования показали, что полимеразная цепная реакция является бо­лее чувствительным, быстрым и более дешевым диагностическим тестом для диагностики наличия микоплазм, чем культуральное исследование (бактериологический посев) [5, 8-10].

Опубликованная ранее [10, 11] суммированная оценка чувствительности различных методов ди­агностики показала, что экспресс-тесты имеют чувствительность 40-60 %, ИФА — 50-70, ПИФ — 55-75, культуральное исследование — 60-80, а ПЦР — 90-100 %. Диагностическая специфичность ПЦР тест-систем, определяемая процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные ре­зультаты анализа, также достаточно высокая и оценивается в 99-100 %.

Таким образом, целью настоящей работы является разработка отечественной диагностической тест-системы для выявления Mycoplasma hominis методом ПЦР в режиме реального времени.

Материалы и методы

Материалом для исследования служили соскобы эпителиальных клеток из уретры у мужчин и из цервикального канала у женщин. Урогенитальные образцы, полученные от пациентов с воспалитель­ными заболеваниями органов репродуктивной системы, использовали для оценки чувствительности и специфичности обнаружения Mycoplasma hominis, а также для сравнения с коммерческой ПЦР-диагностической тест-системой «АмплиСенс Mycoplasma hominis» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотреб-надзора, РФ).

Для выявления ДНК возбудителя использовался ДНК-сорбционный метод (ФГУН ЦНИИЭ, РФ), основанный на специфической обратимой сорбции ДНК в присутствии хаотропных солей (гуанидин-тиоцианат, гуанидинхлорид) на частицы силикагеля.

Амплификацию фрагмента ДНК-мишени fts Y проводили методом TaqMan ПЦР в режиме реаль­ного времени с использованием специфичных праймеров F- (5'-ATT GAT TGC TGC AGG TGA TAC A-3'), R- (5'-GGT GTT ACA ATA TCA GCC CCA AC-3') и зонда (5' R6G-AGA GCA GCG GCA GTT GAA - BHQ2 3'). Объем реакционной смеси 25 мкл включает образец ДНК 5 мкл, 20 мкл MasterMix Qiagen (10 qmol/L каждого праймера и зонда). Температурный профиль реакции: 50 °С 2 мин, 95 °С 15 мин, 45 циклов (95 °С 30 с и 60 °С 60 с) [12].

В процессе оптимизации различных вариантов ПЦР подбирали температурный режим, число и продолжительность циклов амплификации, соотношение зондов и праймеров, концентрацию MgCl2, обеспечивающие максимальную чувствительность и специфичность обнаружения ДНК Mycoplasma hominis.

С целью получения рекомбинантного положительного контроля продукты амплификации кло­нировали с использованием набора Promega pGEM-T Easy в плазмиду pGEM-T. Полученные лигаз-ные смеси использовали для последующей химической трансформации компетентных клеток Escherichia coli. Отбор колоний, содержащих целевой фрагмент, проведен методом сине-белой се­лекции. Отобранные клоны перенесены в жидкую среду LB и инкубированы при 37 °С в течение 16 часов. Из полученных культур выделены плазмиды с применением метода щелочного лизиса. Нук-леотидная последовательность целевых фрагментов, клонированных в плазмиды, определена методом секвенирования с использованием универсальных праймеров М13Ғ (5-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3) и M13R (5-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3).

Проверку на наличие неспецифической гомологии в нуклеотидной последовательности плазми-ды проводили с использованием поисковой системы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/, NCBI).

Результаты и обсуждение

Проведена оптимизация условий амплификации при выявлении возбудителя воспалительных за­болеваний урогенитального тракта Mycoplasma hominis на стандартных и клинических образцах ме­тодом ПЦР в режиме реального времени.

Экспериментальным путем подобраны температурный режим ПЦР и оптимальные концент­рации основных компонентов реакционной смеси, оказывающих значительное влияние на чувстви­тельность и специфичность реакции, так как при снижении температуры отжига ниже оптимальной и при повышении концентрации праймеров и MgCl2 выше оптимальных неспецифичность ПЦР-амплификации повышается, а при повышении температуры отжига выше оптимальной снижается выход специфической амплифицируемой ДНК, вплоть до ее полного исчезновения. Для фрагментов ДНК размером 100 н.п. и меньше требуется уменьшение концентрации дезоксинуклеотидтрифосфа-тов (dNTPs) для повышения эффективности реакции. Фрагменты ДНК Mycoplasma hominis имеют длину 67 н.п.

В таблицах 1-2 представлены подобранные оптимальные условия проведения ПЦР в режиме ре­ального времени и концентрации основных компонентов в реакционной смеси.

Программа амплификации 

Состав реакционной смеси

Исследована аналитическая чувствительность реакции путем тестирования серии последова­тельных разведений плазмидного стандарта, несущего клонированные фрагменты ДНК-мишени Mycoplasma hominis белка fts Y и последующим построением калибровочного графика зависимости порогового цикла от исходной концентрации матриц с определением коэффициента корреляции.

Зависимость значений порогового цикла от логарифма начального числа копий плазмид линей­ная в диапазоне от 50 до 50 млн. копий.

На рисунке 1 представлены результаты определения чувствительности ПЦР при выявлении воз­будителя урогенитальных инфекций Mycoplasma hominis.

Таким образом, выявлены высокая эффективность амплификации (Е = 1,00), рассчитанная на основании крутизны калибровочной прямой, построенной через экспериментальные точки в полуло­гарифмической системе координат, и сильная корреляционная связь (R2 в пределах 0,999) концентра­ции калибровочных образцов ДНК и определяемого значения порогового цикла. Также с большой точностью совпадает количество заданных копий стандарта с фактическим значением, что говорит о достоверности результатов.

В результате разработанная тест-система позволяет с высокой точностью детектировать низкие концентрации ДНК Mycoplasma hominis, что составляет не менее 50 копий в образце, и может быть использована для количественного определения ДНК в анализируемых образцах.

Аналитическую специфичность реакции оценивали на образцах ДНК следующих видов микро­организмов: Ureaplasma spp. (U.parvum/U.urealyticum), Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Gardnerella vaginalis, Candida al­bicans, Herpes simplex virus 1,2. В результате тестирования выяснилось, что неспецифические реакции по данным видам возбудителей отсутствовали.


Для оценки диагностической эффективности проведено сравнение результатов амплификации ПЦР в режиме реального времени разработанной тест-системы для выявления Mycoplasma hominis с российскими коммерческими наборами реагентов «АмплиСенс» производства ФГУН «ЦНИИ эпиде­миологии» Роспотребнадзора, которые имеют государственные регистрационные удостоверения Ми­нистерства здравоохранения РФ и разрешены к использованию в клинической лабораторной диагно­стике.

Определение числа копий Mycoplasma hominis 

Рисунок 1. Определение числа копий Mycoplasma hominis

Результаты амплификации ДНК возбудителя Mycoplasma hominis с гибридизационно-флуорес-центной детекцией в режиме реального времени представлены на рисунке 2.

Результаты амплификации Mycoplasma hominis: а — набор реагентов «АмплиСенс»; б — разработанная тест-система 

Сравнение результатов амплификации показало, что кривые флуоресценции, пересекающие по­роговую линию на стадии характерного экспоненциального нарастания флуоресцентного сигнала, в обоих случаях мало отличаются друг от друга, что доказывает пригодность разработанных нами ПЦР тест-систем в режиме реального времени по выявлению Mycoplasma hominis для применения в диаг­ностике возбудителей урогенитальных инфекций.

 

 

Список литературы

  1. Аскарова Г.К., Маутканов М.Р., Утегенова А.К. Оценка диагностических и прогностических факторов, влияющих на течение и исход беременности // Актуальные вопросы эпидемиологии, клиники, диагностики, профилактики и терапии со­циально-значимых дерматозов и инфекций, передаваемых половым путем: Тез. докл. наIV Междунар. конф., 4-5 октября 2007. — Алматы: Білім, — С. 122-123.
  2. Национальный доклад о ходе работы для ССГАООН: Республика Казахстан (январь 2008 г. - декабрь 2009 г.). — 2010. — 23 с.
  3. Гомберг М.А. Бактериальный вагиноз и новые инфекции, с ним ассоциированные // Российский вестник акушера-гинеколога. — 2010. — № 2.
  4. Руководство «Инфекции, передаваемые половым путем» // Институт здоровья семьи. — 2009. — 168 с.
  5. Shmuel Razin. DNA probes and PCR in diagnosis of mycoplasma infections // Molecular and Cellular Probes. — 1994. — № 8. — Р. 497-511.
  6. Киселев В.И., Дмитриев Г.А., Латыпова М.Ф. Полимеразная цепная реакция в диагностике урогенитальных инфек­ций: Пособие для врачей. — М.: Медицина, 2000. — 16 с.
  7. Карамова А.Э., Поляков А.В., Хамаганова И.В. ЗначениеUreaplasmaurealyticumиMycoplasmagenitaliumкак возбу­дителей воспалительных заболеваний урогенитального тракта // Клиническая микробиология и антимикробная химиотера­пия. — 2004. — Т. 6. — № 4. — С. 365-370.
  8. Abele-Horn M., Wolff C. et al. Polymerase chain reaction versus culture for detection of Ureaplasma urealyticum and My­coplasma hominis in the urogenital tract of adults and the respiratory tract of newborns // J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. — 1996. — № 15(7). — 595.
  9. Petrikkos GL., Hadjisoteriou M., Daikos GL. PCR versus culture in the detection of vaginal Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis // Int. J. Gynaecol. Obstet. — 2007. — № 97(3). — 202. 
  10. Дмитриев Г.А. Современные методы диагностики наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путем // ConsiliumMedicum. — 2002. — № 5. — С. 256-259.
  11. Щербо С.Н. Успехи в диагностике инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции // Медицин­ская картотека. — М.: Медицина, 2002. — 22 с.
  12. Jean Pierre Menard, Florence Fenollar et al. Molecular Quantification of Gardnerella vaginalis and Atopobium vaginae Loads to Predict Bacterial Vaginosis // Clinical Infectious Diseases. — 200 — № 47. — Р. 33-13.
Год: 2011
Город: Караганда
Категория: Медицина
loading...