В результате проведенных исследований был разработан метод ИФА для диагностики вируса чумы мелких жвачных животных. Разработанная тест-система обладает высокой специфичностью и чувствительностью.
Введение
Чума мелких жвачных животных (чума МЖЖ) - la peste des petits ruminants - высококонтагиозное вирусное заболевание, характеризующееся некротическим стоматитом, диареей и бронхопневмонией. Возбудитель – РНК-содержащий вирус, относится к семейству Парамиксовирусов, роду Морбилливирус [1, 2].
В настоящее время для диагностики инфекционных болезней в лабораторных условиях и научных учреждений всё ещё часто используются серологические тесты, такие как РДП, РТГА, РСК, РНГА, МФА, ИФА. Среди них метод ИФА, который благодаря своей простоте и высокой чувствительности [3], зарекомендовал себя как эффективный и современный метод лабораторной диагностики вирусных инфекций сельскохозяйственных животных, пушных зверей и птиц [4].
В связи с этим, целью данной работы являлась разработка отечественного метода ИФА, с использованием диагностических препаратов (сыворотка, иммуноглобулин и конъюгат), приготовленных на основе штамма «Кентау-7» вируса чумы мелких жвачных животных (ЧМЖЖ), выделенного на территории Республики Казахстан из очага эпизоотии.
Материалы и методы
Вирус. В работе использовали штамм «Кентау-7» вируса ЧМЖЖ, выделенного от мелкого рогатого скота во время вспышки эпизоотии в июне 2003 года на территории Республики Казахстан.
Реакция диффузионной преципитации (РДП). Постановку реакции проводили согласно наставлению.
Культуры клеток. Для культивирования штамма «Кентау-7» вируса ЧМЖЖ и получения вируссодержащих суспензий с целью приготовления специфического антигена была использована первично-трипсинизированная культура клеток почки ягненка (ПЯ), выращенная в 1,5 литровых матрасах стационарным методом. Заражение культуры клеток, а также выращивание вируса проводили по отработанным нами условиям.
Животные. В качестве доноров специфических антител применяли взрослых коз и овец в возрасте 9-12 мес.
Антиген. Для иммунизации животных использовали антиген, выделенный из концентрированного и очищенного штамма «Кентау-7» вируса ЧМЖЖ. В качестве стимулятора иммуногенеза использовали сапонин и гидроокись алюминия (ГОА).
Вирусспецифический иммуноглобулин против антигена вируса ЧМЖЖ выделяли спиртовым осаждением по методу Кона и с помощью сернокислого аммония [5, 6, 7].
Вирусспецифический иммунопероксидазный конъюгат получали по методу Wilson и Nakane [8]. Для конъюгации вирусспецифических антител использовали пероксидазу хрена фирмы «Biozyme laboratories» (Ukraine) с чистотой RZ = 2,6-3,4 и удельной активностью по белку от 650 до 1400 Eд/мг. Приготовленные фракции вирусспецифического конъюгата подвергали сублимационному высушиванию с добавлением защитной среды, состоящей из сахарозы, агара и желатина.
Результаты и обсуждение
При оптимизации условий постановки лабораторных тест-систем важную роль играет качество (специфичность и активность) диагностических препаратов, используемых в эксперименте. В связи с этим, необходимо было приготовление антигена вируса ЧМЖЖ для иммунизации животных, с целью получения специфических антисывороток. В результате проведённых исследований был отработан оптимальный метод приготовления антигена из штамма «Кентау-7» вируса ЧМЖЖ с помощью термолизиса. Антисыворотки против данного антигена вируса получали на козах и овцах путём трёхкратного введения очищенного препарата антигена вируса в возрастающей дозе (80-900 мкг). Материал вводили внутримышечно в область предлопаточных лимфатических узлов с интервалом между введениями в 7-сут в комплексе с сапонином (0,05%) - 1 введение и ГОА (1%) - 2 и 3 введение. Оценку активности и специфичности полученных сывороток проводили в РДП. Активность специфических сывороток представлена в таблице №1.
Таблица 1 - Активность и специфичность специфических сывороток против вируса ЧМЖЖ в РДП
Специфические сыворотки крови овец и коз, полученные против вируса ЧМЖЖ в РДП показали довольно высокие результаты, 1:16-1:32 (таблица 1). Одновременно сыворотки показали отрицательные результаты с антигеном нормальным, что указывает на их специфичность.
Для выделения иммуноглобулинов из специфических сывороток крови овец и коз в опыте были испытаны спиртовой метод Кона и метод осаждения сернокислым аммонием. Выделенные иммуноглобулины проверяли на активность и специфичность в РДП, результаты исследований представлены в таблице №2.
Таблица 2 - Оценка активности и специфичности иммуноглобулинов, выделенных спиртовым методом Кона и сернокислым аммонием
В результате установлено, что наиболее активные иммуноглобулины выделены по методу Кона, активность которых составила в РДП – 1:32 (таблица 2).
На основе выделенного иммуноглобулина был приготовлен вирусспецифический иммунопероксидазный конъюгат. Активность приготовленного вирусспецифического конъюгата в ИФА составила – 1:800 и соответственно рабочий титр – 1:100.
С применением приготовленных диагностических препаратов (иммуноглобулин, конъюгат, антигены нормальные и специфические) были проведены исследования по отработке ИФА для обнаружения специфического антигена вируса ЧМЖЖ в различных вируссодержащих препаратах, в ходе которых были испытаны различные температурно- временные условия контакта диагностических препаратов между собой (которые длились от
1 до 3 ч при 37°С и от 16 до 24 ч при 4°С), испытаны сенсибилизирующие дозы иммуноглобулинов и конъюгатов, а также подобраны солевые растворы для разведения диагностических препаратов при постановке ИФА (где испытывались фосфатно-солевой (ФСБ) и фосфатно-буферный растворы (ФБР) с рН 7,2-7,4, а также карбонатно- бикарбонатный буфер (КББ) с рН-9,6 различных молярностей). Данными исследованиями было показано, что наибольшей чувствительности ИФА достигает при следующих параметрах постановки реакции:
- Сенсибилизация лунок полистироловых планшетов вирусспецифическим иммуноглобулином, взятым в рабочей концентрации, в течение 16 ч при температуре 4°С или 3,5 ч при 37ºС с дальнейшей обработкой лунок 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 60 мин при температуре 37°С.
- Время контакта испытуемых и контрольных антигенов с гамма-глобулинами в течение 16 ч при температуре 4°С или 3ч при 37ºС.
- Взаимодействие вирусспецифических конъюгатов с антигенами в течение 60 мин при температуре 37°С, а затем с субстратом в течение 30-60 мин при комнатной температуре.
- Учет результатов реакции проводить на спектрофотометре при длине волны 405 нм (для АБТС).
- Результат считать положительным, если оптическая плотность испытуемого антигена в 2 и более раз превышает оптическую плотность контрольного (нормального) антигена. Оптическая плотность положительных проб должна быть не ниже 0,15.
Следующий этап работы была проверка специфичности и чувствительности ИФА для обнаружения антигена вируса ЧМЖЖ. Специфичность и чувствительность ИФА исследовали, используя антиген специфический вируса ЧМЖЖ; гетерологичные антигены (вирусов оспы овец, катаральной лихорадки овец и контагиозной эктимы овец), нормальные (контрольные) антигены и биоматериалы от павших от вируса ЧМЖЖ животных и от здоровых животных. Постановку реакции осуществляли, как описано выше. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Чувствительность и специфичность ИФА при идентификации антигена вируса ЧМЖЖ
Разработанный нами сэндвич-метод ИФА обладает высокой специфичностью и чувствительностью (таблица 3), так как во всех испытанных гомогенных пробах выявлен специфический антиген данного вируса с активностью от 1:160 до 1:5120. В то же время все нормальные антигены и антигены вирусов гетерологичных возбудителей показали отрицательные результаты в ИФА. 20% суспензии, приготовленные из органов (легкие, кишечник, печень, селезёнка, брыжеечный и предлопаточные лимфатические узлы), взятых от павших животных от данной инфекций также показали положительные результаты в ИФА с активностью 1:8-64, что еще раз подтверждает специфичность и чувствительность разработанной тест-системы.
Выводы
- Для оптимизаций условий постановки ИФА для диагностики ЧМЖЖ были приготовлены специфические и активные диагностические препараты (антиген, сыворотка, иммуноглобулин и конъюгат) на основе штамма «Кентау-7».
- На основе диагностических препаратов были оптимизированы условия постановки ИФА для диагностики ЧМЖЖ.
- Разработанный метод ИФА обладает высокой специфичностью и чувствительностью, применение данного метода в очаге эпизоотии для постановки диагноза даст возможность более оперативно осуществлять противоэпизоотические мероприятия, направленные на блокирование распространения инфекции.
Литература
- Gibbs P., Taylor W.P., Lawman M.J.P., Bryant J. (1979). Classification of peste des petits ruminants virus as the fourth member of the genus morbillivirus. // Intervirology II. pp. 268— 274.
- Murthy F.A., Fauquet C.M., Bishop D.H.L. et. al. (1995). Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. // Virol. -Suppl. 10.
- Самуилов В.Д. Иммуноферментный анализ // Соросовский образовательный журнал. -- №12. - С. 9-15.
- Труды Федерального центра охраны здоровья животных // ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»). - Т. - Владимир: Изд. ООО «Транзит- ИКС». - 2007. – 456 с.
- Фримель Г. Иммунологические методы. М: «Медицина». - 1987. - 472 c.
- Пономарева. Н.А., Нечаева А.С. «Гамма-глобулин» - Москва. – 1985 г.
- Ахмедов А.М. Белки сыворотки крови при инфекционных болезнях животных // М:«Колос». - 1968. - С. 31-36.
- Wilson B., Nakane P.K. Resent development in the periodate method of conjugating horseradish peroxides (HRPO) to antibodies // Biomedical press. -1978. - P. 215-244.