Ящур - высококонтагиозная болезнь парнокопытных животных, к нему восприимчивы практически все виды сельскохозяйственных животных. Вирус ящура распространен по всему миру, в Кыргызстане он регистрируется в форме эпизоотий практически ежегодно. Для адаптации вируса ящура наиболее оптимальной средой является культура клеток ВНК-21. Интенсивность роста вируса и цитопатическое действие на культуре ВНК-21 значительно выше в сравнение с культурой ПК (почки козленка).
Введение
Ящур - остро протекающая, высококонтагиозная болезнь парнокопытных, с клиническими проявлениями в форме лихорадки, везикулярным поражением слизистых оболочек рта, кожи венчика и вымени. У молодых животных в результате переболевания поражается миокард и скелетные мышцы. Ящур относится к наиболее опасным заболеваниям главным образом потому, что он чрезвычайно контагиозен для большого числа видов сельскохозяйственных животных. Наиболее восприимчивы к ящуру крупный рогатый скот, свиньи, овцы, козы, а также северные олени.
Вирус ящура распространен по всему миру, способен наносить экономике стран значительный ущерб. Ликвидация ящура в масштабах отдельно взятой страны не может гарантировать в последующем ее длительное благополучие. [5]
Вирус относится к роду афтовирусов (Aphtovirus) семейства пикорнавирусов (Picornaviridae). Величина вириона 20-30 нм, содержит РНК, хорошо сохраняется при высушивании и замораживании. По иммунобиологическим свойствам подразделяется на 7 типов вируса (А, О, С, CAT1, САТ2, САТЗ, Азия-1) и большое количество подтипов. [2]
Жизнедеятельность вируса ящура можно поддерживать серийными пассажами на естественно-восприимчивых животных (КРС, свиньях, овцах, козах). Однако данный метод высокозатратный и связан с опасностью выноса вируса за пределы учреждения. Поэтому чаще в лабораторных условиях стандартные и полевые штаммы вируса поддерживают на морских свинках, белых мышатах-сосунах, крольчатах и культуре ткани. [3, 4]
Культура клеток представляет собой гомогенную популяцию генетически однородных клеток, растущих в постоянных условиях. Мы можем изменять эти условия в определенных пределах, и оценивать влияние на рост клеток самых различных факторов -рН, температуры, концентрации аминокислот, витаминов и т.п. Рост может быть оценен в течениеопределенного периода времени либо по увеличению числа или размера клеток.
Наиболее чувствительной к вирусу культура клеток первично-трипсинизированной почки коровы, овцы, свиньи и перевиваемой линии ВНК-21.В культуре клеток ВНК-21/13-02 вирус ящура накапливается в количестве 7,01 g ТЦД 50/мл, при содержании иммуногенного компонента до 1 млг/мл. ЦПД проявляется через 6ч и достигает максимума через 18-24ч после заражения. Патологические изменения клеток сопровождаются нарушением межклеточных связей, конденсацией субстрата цитоплазмы, округлением клеток и распадом цитоплазмы. Вирус размножается в цитоплазме. В ядрах происходит укрупнение глыбок хроматина, расположение его вдоль ядерной мембраны, а затем пикноз или рексис ядра. ЦПД вируса ящура развивается без образования включений и симпластов. Вирус ящура относится к вирусам с коротким циклом репродукции, поэтому клеточный монослой быстро разрушается и обычно через 24ч клетки отторгаются от стекла. [1]
Целью данной работы было изучить, как адаптируется вирус ящурак культуре клеток ВНК-21 и ПК (почки козленка). Знание биологических свойств вируса поможет в конструировании противоящурных препаратов.
Материалы и методы
- вирусный материал - вирус ящура типа А, выделенный в неблагополучных по ящуру хозяйствах Чуйской области;
- матрасы со сплошным клеточным монослоем ВНК-21 и ПК;
- реактивы - спирт этиловый, наборы среды Игла, солевой раствор Хенкса, пенициллин, поддерживающая среда;
- оборудование - бокс, морозильник, спиртовка, дозатор, термостат 37°С.
Для заражения клеток отбиралиматрасы со сплошным клеточным монослоем (Фото 1.). Ростовую питательную среду сливали, клетки 1 -2 раза промывали раствором Хенкса, чтобы удалить сывороточные антитела и ингибиторы.
В матрасы вносили 150мкл вируссодержащего материала (вирус ящура типа А выделенный в Чуйской области) и покачиванием распределяли его равномерно по слою клеток. В таком виде матрасы оставляли на 1ч при 37°С для адсорбции вируса на поверхности клеток. Затем вируссодержащий материал удаляли из матраса и ввели поддерживающую среду. Матрасы закрыли герметичной резиновой пробкой и ставили на инкубацию в термостат при 37°С, в горизонтальном положении.
Зараженный матрас ежедневно исследовали под электронным микроскопом на происходящие процессы.
Результаты исследования
Технология культивирования вируса ящура на культуре клеток состоит в следующем. В зараженном матрасе адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают внутрь их, и начинается их репродукция. Новые вирусные частицы покидают (полностью или частично) клетки, в которых они образовались, проникают в непоражённые клетки, репродуцируются в них, переходят в новые клетки и поражают их. Так продолжается до тех пор, пока есть живые неповрежденные клетки. В результате происходящего процесса практически основная масса клеток в матрасе поражается вирусом.
На фото 2 отображены результаты индикации вируса в культуре клеток которые оказались неодинаковы по цитопатическому эффекту или цитопатическому действию (ЦПЭ, ЦПД) (Фото 2).О размножении вируса в культуре клеток судят по цитопатическому эффекту или цитопатическому действию. Цитопатическое действие - это любые изменения клеток в культуре клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Физиологические изменения клеток установить довольно сложно, а морфологические изменения обнаруживаются довольно легко. Для этого достаточно использовать электронный микроскоп и осмотреть монослой в матрасе. Полезно сравнить клетки, зараженные вирусом, с такими же клетками в матрасе, не подвергающиеся заражению. В этом случае практически любые наблюдаемые в микроскопе отличия зараженной культуры клеток от контрольной можно считать проявлением ЦПД. Эти отличия могут захватывать весь монослой или отмечаться только в виде небольших очажков изменённых клеток в слое нормальных клеток. Интенсивность ЦПД выражается тем, какая часть клеточного монослоя изменена вирусом. ЦПД часто оценивают в крестах или баллах. Вирус ящура проявил ЦПД через 1 -2 суток после заражения монослоя.
В наших экспериментах как видно, клетки становятся более вытянутые, их контуры
На четвертый день после заражения видно, как образовались гигантские синцитиальные, многослойные скопления клеток, содержащие по 1000 ядер (Фото 3.).
На шестой день наблюдения, очевидно что, клетки истощены, нарушается целостность клеточного монослоя. В некоторых местах клетки повреждены и отслаиваются от стекла. (Фото 4.)
Как видно по фотографиям на 2-й день зараженияв матрасе ВНК-21 (ЦПД - 20%) по сравнению с матрасом ПК (ЦПД - 10%) на второй день заражения ЦПД проявляется интенсивнее, на четвертый день ЦПД в матрасе ВНК-21 составило 40% всего матраса, когда в ПК составило всего 20%, а на шестой день ЦПД в матрасах ВНК-21 и ПК было одинаково и составило примерно 70%. По нашим наблюдениям вирус ящура в матрасе ВНК-21 заражает клетки быстрее, чем в матрасе ПК.
Выводы
Таким образом, вирус ящура активнее адаптируется на культуре клеток ВНК-21 по сравнению с культурой ПК. И как показали наши наблюдения, цитопатическое действие вируса ящура на ВНК-21 более активное. Данная культура клеток более всего подходит для культивирования вируса ящура.
Литературы
- Л.П. Дьяконов, В.Ф. Глухов, А.А. Поздняков, Г.Ф. Денисенко, Т.П. Калмыкова//Культивирование клеток и тканей животных//Учебно-методическое пособие -Ставрополь, 1986.
- Н.И. Троценко, Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская//Практикум по ветеринарной вирусологии - Москва, 1989.
- В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьёв, Н.В. Фомина//Вирусные болезни животных - Москва, 1998.
- З. Лярски//Диагностика вирусных болезней животных - Москва, 1980. А.П. Пономарев, В.Л. Узюмов, К.Н. Груздев // Вирус ящура. Владимир, 2006.
- Т.Б. Белеков // Ящур сельскохозяйственных животных / Т.Б. Белеков, Д.Р. Раимбеков, Г.А. Искембаева (Методическое руководство). - Бишкек. Алтын-Тамга, 2001.