Разработка иммуноферментного анализа для диагностики c. Perfringens

Получены очищенные антигены возбудителя C. perfringens по методу Grasset и кипячения, активность у которых в РДП составила 1:8-1:16 и 1:16-1:32 соответственно. Активная специфическая сыворотка к возбудителю C. perfringens получена на кроликах, активность в РДП составила 1:16 и 1:32, а в ИФА 1:800-1:3200. Для иммунизации кроликов использованы антигены приготовленной по методу кипячения. Специфическая сыворотка к возбудителю C. perfringensв опыте использованы для выделения иммуноглобулина и приготовления конъюгата. На основе приготовленных диагностических препаратов был разработан метод иммуноферментного анализа (ИФА), пригоден для диагностики возбудителя C. perfringens

Введение

В связи с развитием клеточных технологий, молекулярной биологии, генетики, физики, химии и ряда других высокотехнологичных дисциплин в повседневную практику внедряются новые высокоточные и высокотехнологичные методы. Данные междисциплинарные тенденции затрагивают и область ветеринарных знаний, и смежные области биологических, биохимических проблем. Широкое  распространение и внедрение в массовую практику получил метод лабораторной диагностики под названием иммуноферментный анализ [1].

ИФА - это лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов, а также иммуноглобулинов и гормонов.

Метод ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью, которая в настоящее время составляет более 90%.

Метод ИФА дает возможность определения антител (IgG, IgA, IgM) к возбудителям инфекции в крови. Эти антитела вырабатываются организмом в ответ на инфицирование. Антитела выявляются при взаимодействии со специальными препаратами, содержащими соответствующие антигены, образующие с антителами прочный комплекс, который можно обнаружить разными способами [2].

В основе метода лежит принцип взаимодействия иммуносорбента — антигена возбудителя инфекции с выявляемыми антителами [3].

Таким образом, за счет несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счет автоматизации учета результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики [4-7].

Достоинства ИФА — возможность ранней диагностики инфекции, возможность прослеживать динамику развития процесса, быстрота и удобство в работе.

Недостаток ИФА — относясь к непрямым методам диагностики, он позволяет определить иммунный ответ организма на возбудителя, а не сам возбудитель [8].

ИФА широко используется для диагностики всевозможных инфекций (хламидиоз, токсоплазмоз и др.), как острых, так и хронических, а также скрытых форм, которые протекают без клинических симптомов.Также этот метод применяют для контроля над хроническими заболеваниями [9, 10].

В связи с этим, цель данной работы проведение исследований по разработки условий постановки ИФА для диагностики C. perfringens.

Так как последние 5 лет на территории Республики Казахстан данная инфекция часто поражает домашних и в том числе диких животных [11].

Материалы и методы

Возбудитель. В работе использовали штамм Clostridium/Saigas/2010/ZKO/KZ возбудителя C. perfringens, выделенный от павшего сайгака из Западно-Казахстанской области в 2010 г.

Специфические иммуноглобулины  к  антигену             штамма Clostridium/Saigas/2010/ZKO/KZ возбудителя C. perfringens из антисывороток выделяли спиртовым методом по Кону [12].

Специфические конъюгаты получали по методу Wilson и Nakane [13]. В работе использовали пероксидазу хрена фирмы "Сигма" (США) типа VI-А. Подбирали оптимальное рабочее разведение коньюгата, дающее максимальную цветовую реакцию при внесении его в планшеты с антигеном.

Для проверки специфичности тест-системы ТФ-ИФА использовали культуральные антигены из штамма Clostridium/Saigas/2010/ZKO/KZ возбудителя C. perfringens, бульонную суспензию возбудителя C. perfringens, нормальный культуральный антиген, гетерогенные специфические антигены (возбудителя E.coli, Y.enterocolitica 842, Y.pseudotuberculosis 2841).

Концентрацию белка в антигенах из штамма Clostridium/Saigas/2010/ZKO/KZ возбудителя C. perfringens определяли с помощью спектрофотометра BoecoS-30 по методу Лоури [14].

При подборе наиболее чувствительных полистироловых планшетов для постановки ИФА при возбудителе C. perfringens были испытаны планшеты следующих фирм-производителей:   «Costar»   (США),   «Nunc»,   DenmarkF,   maxiSorpF     (Дания), «Союзмедполимер», Москва и Ленинград (Россия), Labsystems Finland, Linbro/Titertek (США), Италия.

При отработке оптимальных условий постановки ИФА были испытаны различные буферные растворы для разбавления компонентов реакции, а также временные и температурные условия экспозиции иммуноглобулина, антигенов, и конъюгата.

Учет результатов ИФА проводили на фотометре марки «MultiskanPlus» при длине волны 405 нм. Результат считали положительным, если оптическая плотность испытуемого антигена в два и более раза превышала оптическую плотность нормального антигена.

Результаты исследований

Известно, что метод ИФА применяют для диагностики бактериальных и вирусных инфекций во многих странах. Однако методы ИФА отличаются между собой  по многим параметрам и имеют специфические особенности.

Для получения активных и специфичных антисывороток к возбудителю C. perfringens необходимо было подобрать методы очистки и концентрирования антигена из биомассы.

Для приготовления антигена C. perfringens были испытаны 2 способа очистки наработанной и инактивированной бактериальной массы. 1 способ – по методу Grаsset[15]. 2  способ – по методу кипячения [16-18].

Активность в РДП антигенов, очищенных по первому способу, составила 1:8-1:16, по второму способу 1:16-1:32, а концентрация белка в приготовленных антигенах к возбудителю  C.  perfringens  по  методу  Grassetсоставила  17,2  мг/мл,  а  по       методу кипячения 204,9 мг/мл. Наиболее активные и специфичные антисыворотки  получены на кроликах, с использованием антигена приготовленного по методу кипячения, активность которых составили в РДП 1:16 и 1:32 и в ИФА 1:800-1:3200 соответственно. Из полученных антисывороток выделены вирусспецифические иммуноглобулины с использованием спиртового метода по Кону[13]. Активность иммуноглобулина выделены  по методу Кона составила в РДП – 1:32.

На основе выделенного иммуноглобулина приготовлены вирус специфический иммунопероксидазный конъюгат [13]. Рабочая активность конъюгата в ИФА составила – 1:50. Конструирование      иммуноферментной      тест-системы       включает подбор оптимальных параметров постановки реакции, от которых зависят чувствительность   и специфичность разрабатываемой тест-системы.

Оптимальную сенсибилизирующую дозу иммуноглобулинов определяли в опыте “шахматного титрования” со специфическими и нормальными антигенами. Специфический иммуноглобулин испытывали в разведениях от 1:100 до 1:12800.

Предельный титр иммуноглобулина, который позволяет выявить специфический антиген штамма Clostridium/Saigas/2010/ZKO/KZвозбудителя C. perfringensв его максимальном титре, составил 1:1600, а рабочее разведение 1:100. Исходя из этого, в дальнейшем для сенсибилизации использовали данную дозу специфического иммуноглобулина.

С целью снижения неспецифических реакций были испытаны различные концентрации бычьего сывороточного альбумина (БСА), а также различные буферные растворы для ресуспендирования антигенов, конъюгата, и в качестве промывочного раствора. Были исследованы концентрации БСА 0,1%, 0,5%, 1%, 2%. Исследования, проведенные в этом направлении, позволили установить, что блокирование свободных центров связывания на планшете целесообразно проводить 1% раствором БСА на фосфатно-солевом буфере с рН 7,4 с добавлением 0,1% Твин-80.

Для определения оптимальной концентрации приготовленного иммуно пероксидазного конъюгата при проведении ТФ-ИФА подбирали его оптимальное рабочее разведение, дающее максимальную цветовую реакцию при внесении в полистироловые планшеты. Предельным титром иммунопероксидазного конъюгата считали его максимальное разведение, которое способно выявить специфический антиген штамма Clostridium/Saigas/2010/ZKO/KZ возбудителя C.perfringens, при отрицательном результате с нормальным антигенам. Конъюгат исследовали в разведениях от 1:50 до 1:12800. За оптимальное рабочее разведение конъюгата принимали его восьмикратный предельный титр, который составил – 1:50.

При оптимизации условий постановки ИФА также были испытаны сорбционные свойства твёрдой фазы, в качестве которой использовали 96-луночные планшеты для ИФА. С этой целью проводили титрование иммуноглобулинов в планшетах различных производителей. В результате проведенных опытов установлено, что максимальной способностью сорбировать иммуноглобулин с однородностью сорбции обладают планшеты фирмы LabsystemsFinland и Costar. Другие испытанные планшеты обладали меньшей сорбционной способностью и однородностью сорбции.

С использованием подобранных оптимальных параметров постановки ИФА были проведены исследования по определению специфичности и чувствительности разработанной тест-системы.

Результаты исследований по применению отработанного ИФА для    диагностики

  1. perfringens представлены в таблице 

Таблица 1 - Результаты постановки ИФА по выявлению возбудителя C.рerfringens

 Результаты постановки ИФА по выявлению возбудителя C.рerfringens 

Из данных таблицы 1 видно, что разработанный ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Антигены возбудителя C. perfringensвыявлены в культуральных пробах в титрах 1:32-1:2048. Все нормальные и гетерологичные пробы показали отрицательные результаты в ИФА.

Специфичность, эффективность и пригодность разработанной ИФА тест-системы были проверены при исследований биоматериалов, взятых от павших архара и жирафа из Алматинского зоопарка.

В ходе исследований проб получены следующие результаты, которые указаны в таблице 2. 

Таблица 2 – Результаты исследований биоматериалов

  Результаты исследований биоматериалов

В ходе исследовании, установлены, что в двух пробах исследованных 6-ти пробах архара и 7-и пробах исследованных 8-и пробах жирафа были выявлены антиген возбудителя C. perfringens. Полученные данные подтверждены с помощью методами полимеразной цепной реакции и реакции диффузионной преципитации.  Таким образом, разработанный метод ИФА апробированы при проведении экспертизы культуральных и полевых проб возбудителя C. perfringens.

Заключение

В результате проведенных исследований, с применением концентрированных и очищенных препаратов антигенов C. perfringens, приготовленных по второму способу, получены активные и специфичные антисыворотки против C. perfringensна    кроликах.

На основе данных антисывороток приготовлены диагностические препараты для метода ТФ-ИФА.

Установлены оптимальные параметры и условия постановки разработанного теста: сенсибилизация лунок планшетов фирм Labsystems Finland или Costar иммуноглобулинами в разведении 1:100, ресуспендированных 0,15М физиологическом буфере рН 7,2, блокирование свободных сайтов связывания 1% раствором БСА в буферном растворе, время экспозиции иммуноглобулина с лунками планшета – 18ч при 4°С или 3 ч при 37°С, время экспозиции антигенов с иммуноглобулином 18ч при 4°С или 3 ч при 37°С, время инкубирования иммунопероксидазного конъюгата с антигеном на иммуносорбенте 60 мин (±5) при 37°С.

В результате проведенных испытаний установлены высокая специфичность и чувствительность тест-системы при исследовании антигенов возбудителя  C. perfringens, что свидетельствует о её пригодности для диагностики данного возбудителя.

 

Литература 

  1. Иммуноферментный анализ / Редакция Т.Т. Нго, Г. Ленхофф. М.: Мир,
  2. Егоров А. М., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е. М. Теория и практика иммуноферментного анализа. 1991, Москва: Высшаяшкола.
  3. Tijssen , Practice and theory of enzyme immunoassays. 1985, Amsterdam; New York: Elsevier ; New York, USA : Sole distributors for the USA and Canada, Elsevier Science Pub. Co. 502.
  4. Абелев Г.И. Основа иммунитета // Соросовский Образовательный журнал. 1996. №5. С.4-10.
  5. Галактионов В.Г. Как работает иммунная система // Там же. 1997. №12. С.2-9. 6 Абелев Г.И. Моноклональные антитела // Там же. 1998. №1. С.16-20.
  6. Березин И.В. и др. Биотехнология / Ред. Н.С. Егоров, В.Д. Самуилов. М.: Высшая школа, 1987. Кн.8: Инженерная энзимология.
  7. Егоров А.М. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш.Шк., 1991.
  8. Dwyer R.St.C. Chlamydial infection. Results of micro-immunofluorescence tests for the detection of type-specific antibody in certain chlamydial infections // Brit. J. Vener. Dis. - 1972. - Vol. 48. - P. 452-459.
  9. Hill , Dubey J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention // Clin. Microbiol.Infect. 2002. № 10.
  10. Орынбаев М. Б., Рыстаева Р. А., Керимбаев А.А., Копеев С.К., Коспанова М, Н., Кыдырбаев Ж.К. Случаи массовой гибели уральской популяции сайгаков в Казахстане//Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 1 (17), 03. 2013 г. Санкт-Петербург С. 20-26
  11. Фримель Г. Иммунологические методы. М: «Медицина», 1987. - 472 с.
  12. Wilson M.B., Nakane P.K. Resent development in the periodate method of conjugating horseradish peroxides (HRPO) to antibodies // Biomedical press. 1978. - PР. 215- 244.
  13. Lowry H., Rosebrough N.I., Farr A.L. et al. // J. biol. Chem. - 1951. - v. 193, P.265-275.
  14. Grasset E. - C.R.Soc.Biol. 1935.v.118. 765 p.
  15. Быченко Б. Д.- Журнал микробиология. - №2. - С. 131-135.
  16. Гусев А.И., Цветков В.С. Лабораторное дело.- - № 2.- С. 43-45.
  17. Матвеев К.И.- Журнал микробиология.- - № 10-11.- С. 37-40.
Фамилия автора: Абеуов К., Кошеметов Ж.К., Нурабаев С.Ш., Сугирбаева Г.Д., Матвеева В.М., Богданова М. И.
Год: 2014
Город: Алматы