Другие статьи

Цель нашей работы - изучение аминокислотного и минерального состава травы чертополоха поникшего
2010

Слово «этика» произошло от греческого «ethos», что в переводе означает обычай, нрав. Нравы и обычаи наших предков и составляли их нравственность, общепринятые нормы поведения.
2010

Артериальная гипертензия (АГ) является важнейшей медико-социальной проблемой. У 30% взрослого населения развитых стран мира определяется повышенный уровень артериального давления (АД) и у 12-15 % - наблюдается стойкая артериальная гипертензия
2010

Целью нашего исследования явилось определение эффективности применения препарата «Гинолакт» для лечения ВД у беременных.
2010

Целью нашего исследования явилось изучение эффективности и безопасности препарата лазолван 30мг у амбулаторных больных с ХОБЛ.
2010

Деформирующий остеоартроз (ДОА) в настоящее время является наиболее распространенным дегенеративно-дистрофическим заболеванием суставов, которым страдают не менее 20% населения земного шара.
2010

Целью работы явилась оценка анальгетической эффективности препарата Кетанов (кеторолак трометамин), у хирургических больных в послеоперационном периоде и возможности уменьшения использования наркотических анальгетиков.
2010

Для более объективного подтверждения мембранно-стабилизирующего влияния карбамезапина и ламиктала нами оценивались перекисная и механическая стойкости эритроцитов у больных эпилепсией
2010

Нами было проведено клинико-нейропсихологическое обследование 250 больных с ХИСФ (работающих в фосфорном производстве Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции)
2010


C использованием разработанных алгоритмов и моделей был произведен анализ ситуации в системе здравоохранения биогеохимической провинции. Рассчитаны интегрированные показатели здоровья
2010

Специфические особенности Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции связаны с производством фосфорных минеральных удобрений.
2010

Мониторинг, выделение, идентификация и культивирование герпесвируса  лошадей  на территории Республики Казахстан

В работе представлены результаты исследований биологических проб, отобранных от больных лошадей с признаками респираторного заболевания, а так же результаты выделения герпесвируса лошадей и изучения культуральных свойств выделенного вируса. Установлено, что заболевание животных в хозяйствах Т. Рыскуловского и Кордайского районов Жамбылской области вызвано герпесвирусом лошадей. Выделен эпидемиологически актуальный для территории РК изолят герпесвируса лошадей 4 серотипа. Отработаны оптимальные условия культивирования герпесвируса лошадей 4 серотипа, позволяющие нарабатывать вирусную массу для приготовления диагностических и профилактических препаратов.

Введение

К одним из широко распространенных вирусных заболеваний относятся герпесвирусные инфекции лошадей. В настоящее время известны герпесвирусы лошадей 9 типов, представленные альфа – и гаммагерпевирусами. Из герпесвирусных болезней лошадей наибольшее экономическое значение имеют инфекции, возбудителями которых являются ВГЛ-1, вызывающий массовые аборты у кобыл, патологию органов дыхания у жеребят, спорадические случаи миелоэнцефалопатии у лошадей, независимо от возраста и физиологических особенностей; ВГЛ-4 – возбудитель ринопневмонии и спорадических абортов; ВГЛ-3 – возбудитель коитальной экзантемы лошадей, острого контагиозного заболевания, при котором поражается эпителий влагалища у кобыл и полового члена у жеребцов; ВГЛ-9 – возбудитель миелоэнцефалопатии лошадей и других гетерогенных хозяев:  газелей, зебр, антилоп - часто с летальным исходом. Вирусы 2 и 5 типов (гаммагерпесвирусы) вызывают латентную инфекцию, а также участвуют в развитии респираторных поражений у жеребят. Наиболее значимые для коневодства заболевания вызывают вирусы 1-го (вирусный аборт) и 4-го (ринопневмония) типов [1, 2].

Ринопневмония - это вирусная инфекция лошадей, которая может проявляться поражением органов дыхания, абортами, пневмонией новорожденных жеребят или миелоэнцефалитами. Ранее заболевание было описано разными названиями: вирусный аборт кобыл, половая экзантема лошадей, катаральная инфлюэнца, герпес, ринотрахеит лошадей [1-3].

В естественных условиях болеют лошади, пони, ослы и мулы всех возрастов и пород независимо от пола. Более чувствительны чистокровные породы и молодняк до 1 года.

Различные штаммы вируса ринопневмонии размножаются в первичных культурах и субкультурах почек лошадей, пони, свиньи, теленка, овцы, тестикуллов, легких и селезенки лошади, а также в перевиваемых линиях клеток BHK-21, AND, HeLa, RK-13. Размножение вируса в чувствительных культурах клеток сопровождается развитием цитопатических изменений характерных для вирусов группы герпес. Штаммы вируса, адаптированные к культурам клеток, оказывают более выраженный цитопатический эффект и накапливаются в высоких титрах. Цитопатогенное действие адаптированных штаммов наступает через 24-48 часов, а неадаптированных через 3-5 суток. Первым признаком цитопатических изменений служит появление отдельных округленных светлых клеток через 24-36 часов после заражение. В менее чувствительной к вирусу перевиваемой линии клеток почки теленка цитопатическое изменения в первые 2-3 суток имеют очаговый характер, затем они постепенно распространяются по всему монослою клеток. Пораженные клетки округляются и отделяются от стекла, в них образуются внутриядерные эозинофильные тельца-включения [4].

Ранее нами было показано, что ГПЛ 1 и 4 серотипов циркулируют в популяциях лошадей в различных регионах РК [5, 6].

Целью настоящей работы было определение эпизоотической ситуации по герпесвируса лошадей в различных регионах РК, выделение эпидемиологически актуального штамма герпесвируса лошадей циркулирующего на территории РК и изучение культуральных свойств выделенного вируса.

Материалы и методы

Материалом   для   исследования   служили   114   проб   (из   них   105   смыва,   9 патологических материалов) от лошадей разных регионов Казахстана.

При постановке ПЦР в качестве положительного контроля использовали ДНК вакцинного штамма СВ/69.

Выделение ДНК из образцов проводили с помощью набора «Viral DNA Mini Kit»,

фирмы «Qiagen», в соответствии с инструкцией производителя.

Для выявления ГВЛ лошадей использовали праймеры специфические на ГВЛ 1- серотипа BS-1-P1и gB1-R-2 (1-раунд), BS-1-P3 и gB1-R-a (2-раунд), а также праймеры специфические на ГВЛ 4-серотипа BS-4-P1 BS-4-P2 (1-раунд), BS-4-P3 и BS-4-P4 (2- раунд) [5].

ПЦР проводили с помощью коммерческого набора фирмы «Invitrogen».

Реакционная смесь для постановки реакции состояла из следующих компонентов: вода - 31,5 мкл; 10хбуфер - 5 мкл; dNTPS - 1 мкл; R праймер - 5 мкл; F праймер - 5 мкл; MgCl2 - 2,5 мкл; TaqDNA polymerase - 0,5 мкл; ДНК - 2 мкл.

Постановку ОТ-ПЦР проводили при следующем температурном режиме: преденатурация – 94 °С - 4 мин; денатурация – 94 °С – 30 сек; отжиг - 60 °С - 30 сек; репликация – 72 °С – 90 сек, пост-репликация – 72 °C – 10 мин.

Амплификацию проводили на приборе «MasterCycler» фирмы «Eppendorf», в течение 40 циклов.

Электрофоретическое  разделение  продуктов  амплификации  проводили  в  1,5 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия.

Анализ  продуктов  амплификации  проводили  в  1,5  %  агарозном  геле  на  TAE

буфере. Размер ампликона на 1серотип - 770 п.о., на 4 серотип - 580 п.о.

Электронную микроскопию проводили методом негативного контрастирования с использованием 4 % раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты с рН 6.8. Вирус из органо-тканевого материала выделяли методом ультрацентрифугирования при 35000 об/мин в течение 45 мин из осветленного гомогената. Адсорбцию вируса на сетки с фарфоровой подложкой напыленной углеродом проводили на капле вируссодержащей жидкости в лунке тефлоновой пластины. Время адсорбции составляло 10 мин. После адсорбции сетку с образцом контрастировали на капле фосфорно-вольфрамовой кислоты в течение 5 мин и после просушивания исследовали в  электронном микроскопе JEM-100 CX II JEOL при ускоряющем напряжении 80 Kv и увеличении 20-40 тысяч.

Культуры клеток выращивали в среде Игла МЕМ с добавлением 2 мМ глутамина, 5 % сыворотки крови КРС для культур клеток, пенициллина по 100 ЕД/мл и стрептомицина по 100 мкг/мл.

Для выделения вируса использовали однодневную диплоидную клеточную культуру почки кролика (RK-13). Для этого с пробирок (матрасов) со сплошным клеточным монослоем сливали ростовую питательную среду, клетки 1 - 2 раза промывали раствором Хенкса для удаления сывороточных антител и ингибиторов. В каждую пробирку (матрас) вносили соответствующее количество вируссодержащего материала и с помощью покачивания распределяли его равномерно по слою клеток и для адсорбции вируса оставляли в течение 1 - 2 часа при комнатной температуре. После этого вируссодержащий материал удаляли и добавляли поддерживающую среду (в пробирку 1 - 2 мл, в матрасы около 10% объёма). Инкубировали в термостате при 37 оС. Все пробирки (матрасы) после заражения клеток ежедневно исследовали под малым увеличением микроскопа на наличие цитопатического действия (ЦПД), сравнивая культуры клеток, заражённые вирусом, с контрольными. Титр вируса определяли по инфекционному действию на культуру клеток и оценивали по методу Рида и Менча [7].

Результаты и обсуждение

С целью выяснения эпизоотической ситуации в РК по ринопневмонии лошадей в 2011-2012 гг. нами был проведено обследование хозяйств Жамбылской, Южно- Казахстанской, Алматинской, Костанайской, Северо-Казахстанской областей и собрано 114 проб патологического материала от абортированных плодов лошадей и носоглоточных смывов.

Исследование проб, доставленных из различных регионов РК, на наличие вируса ринопневмонии проводили методом ОТ-ПЦР и электронной микроскопии. Результаты исследования биологических проб в ПЦР представлены в таблице 1.

 Таблица 1 - Результаты ОТ-ПЦР на ГВЛ 

   Результаты ОТ-ПЦР на ГВЛ

В результате проведенных исследований установлено, что в 1 пробе из 5 доставленных из с. Отар Кордайского района Жамбылской области выявлен ГВЛ серотипа 1, в двух пробах из 5 доставленных из ТОО ЛКЗ Т.Рыскуловского района Жамбылской области выявлен ГВЛ серотипа 4, в пробах доставленных из п.Кордай Кордайского района Жамбылской области выявлен ГВЛ обоих серотипов.

Для выделения вирусов использовали диплоидную клеточную культуру почки кролика RK-13. Материалом для выделения вируса служили 20 % суспензии из паренхиматозных органов (легких, печени, селезенки), содержимое желудка плода и смывы из носовой полости.

В результате проведенных исследований на первом пассажном уровне из материала, доставленного из Т.Рыскуловского района Жамбылской области, был выделен цитопатогенный агент. Специфическое цитопатогенное действие наступало через 24-36 часов, первым признаком цитопатических изменений служило появление отдельных округленных, светлых клеток через 36 часов после заражения, затем они постепенно распространялись на весь клеточный пласт.

ПЦР исследование выделенного возбудителя позволило идентифицировать ГВЛ 4 серотипа.

В результате электронномикроскопических исследований в  культуральных пробах был обнаружен вирус, который по морфологии и размерам вириона характерно к ГВЛ. Вирион имеет суперкапсид (наружную оболочку) диаметром 200-210 нм и центральный капсид гексогональной формы диаметром 80-90 нм (рисунок 1). 

  Электронная фотография герпесвируса лошадей (негативное контрастирование 2 % раствором ФВК. *120 000)

Рисунок 1 – Электронная фотография герпесвируса лошадей (негативное контрастирование 2 % раствором ФВК. *120 000)

С целью изучения культуральных свойств выделенного возбудителя было проведено 3-7 последовательных пассажей с использованием 1-2 суточной культуры клеток Vero, RK-13, BHK-21, СПЭВ, ПТ-80.

Культивирование проводили в стационарных условиях в матрасах и пробирках в течение 2-10 суток при 37 оС до 70-90 % поражения монослоя клеток. Полученные пробы вируссодержащего материала каждого пассажного титровали в одноименной культуре клеток с целью определения биологической активности.

Результаты исследований по определению чувствительности различных культур клеток к вирусу ГПЛ представлены в таблице 2.

 Таблица 2 – Чувствительность различных культур клеток к вирусу ринопневмонии лошадей

  Чувствительность различных культур клеток к вирусу ринопневмонии лошадей

В результате проведенных исследований было установлено, что наиболее активные вирусные материалы получены в культуре клеток RK-13, на уровне 3-го пассажа титр вируса составлял 6,58 ± 0,08 lg ТЦД50/см3. Цитопатическое действие вируса проявлялось на 1-2 сутки.

Менее чувствительными культурами клеток оказались ПТ-80 и Vero, титр на уровне 7-го пассажа вируса составлял 3,50 ± 0,25 и 4,50 ± 0,09 ТЦД50/см3, соответственно. ЦПД не было отмечено в перевиваемых культурах клеток BHK-21 и СПЭВ.

В дальнейших исследованиях использовали перевиваемую линию культуры клеток RK-13.

Отработка оптимальных условий культивирования показало, максимальное накопление вируса ГВЛ 4 серотипа в культуре клеток при заражающей дозе от 0,01 до 1,0 ТЦД50/см3 с инкубированием при 37 оС в течение 2-3 суток обеспечивает получение вируса с биологической активностью до 6,58 ± 0,08 lg ТЦД50/см3.

Выводы

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что ГВЛ обоих серотипов циркулирует среди конепоголовья Жамбылской области. В культуре клеток RK-13 выделен изолят ГВЛ 4 серотипа. Отработаны оптимальные условия культивирования ГВЛ 4 серотипа, позволяющие нарабатывать вируссодержащую суспензию пригодную для приготовления диагностических и профилактических препаратов.

 

Литература 

  1. Юров К.П. Инфекционные болезни лошадей // Изд-во «Грааль». – 2000. – С.19 -36.
  2. OIE - World organization for animal health / World Animal Health Information Database (WAHID) Interface //http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/ Countryinformation / Countryre ports
  3. Patel J.R., Heldens J. Equine herpesviruses 1 (EHV-1) and 4 (EHV-4)-epidemiology, disease and immunoprophylaxis: a brief review // Vet J. – 2005. – Vol. 170, № – P. 14-23.
  4. Татаурова А. В., Юров К. П., Алексеенкова С. В. Нейропатогенные штаммы возбудителя ринопневмонии – вирусного аборта лошадей. // Ветеринария, 3,– 23.– С.20
  5. Омарова З., Керимбаев А., Мусаева Г., Орынбаев М.Б. Обнаружение и типирование герпесвируса лошадей методом ПЦР // Сборник материалов международной научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 55- летию НИИПББ. Гвардейск-2013г. С.152-159
  6. Шалгынбаев Э., Рябинникова А., Рыстаева Р., Омарова З., Орынбаев М.Б. Выделение и культивирование вируса ринопневмонии лошадей на культуре клеток // Материалы 2-ой международной научно-практической конференции молодых ученых, посвященный дню образования НИИПББ. Гвардейск, август, 2014 г. С.196-200
  7. Reed J. A simple method of estimating fifty per cent endpoints // Am. J. Hyd. – 1938. –Vol.27. – P. 493-497.

Разделы знаний

Архитектура

Научные статьи по Архитектуре

Биология

Научные статьи по биологии 

Военное дело

Научные статьи по военному делу

Востоковедение

Научные статьи по востоковедению

География

Научные статьи по географии

Журналистика

Научные статьи по журналистике

Инженерное дело

Научные статьи по инженерному делу

Информатика

Научные статьи по информатике

История

Научные статьи по истории, историографии, источниковедению, международным отношениям и пр.

Культурология

Научные статьи по культурологии

Литература

Литература. Литературоведение. Анализ произведений русской, казахской и зарубежной литературы. В данном разделе вы можете найти анализ рассказов Мухтара Ауэзова, описание творческой деятельности Уильяма Шекспира, анализ взглядов исследователей детского фольклора.  

Математика

Научные статьи о математике

Медицина

Научные статьи о медицине Казахстана

Международные отношения

Научные статьи посвященные международным отношениям

Педагогика

Научные статьи по педагогике, воспитанию, образованию

Политика

Научные статьи посвященные политике

Политология

Научные статьи по дисциплине Политология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Психология

В разделе "Психология" вы найдете публикации, статьи и доклады по научной и практической психологии, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. В своих работах авторы делают обзоры теорий различных психологических направлений и школ, описывают результаты исследований, приводят примеры методик и техник диагностики, а также дают свои рекомендации в различных вопросах психологии человека. Этот раздел подойдет для тех, кто интересуется последними исследованиями в области научной психологии. Здесь вы найдете материалы по психологии личности, психологии разивития, социальной и возрастной психологии и другим отраслям психологии.  

Религиоведение

Научные статьи по дисциплине Религиоведение опубликованные в Казахстанских научных журналах

Сельское хозяйство

Научные статьи по дисциплине Сельское хозяйство опубликованные в Казахстанских научных журналах

Социология

Научные статьи по дисциплине Социология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Технические науки

Научные статьи по техническим наукам опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физика

Научные статьи по дисциплине Физика опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физическая культура

Научные статьи по дисциплине Физическая культура опубликованные в Казахстанских научных журналах

Филология

Научные статьи по дисциплине Филология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Философия

Научные статьи по дисциплине Философия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Химия

Научные статьи по дисциплине Химия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Экология

Данный раздел посвящен экологии человека. Здесь вы найдете статьи и доклады об экологических проблемах в Казахстане, охране природы и защите окружающей среды, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. Авторы рассматривают такие вопросы экологии, как последствия испытаний на Чернобыльском и Семипалатинском полигонах, "зеленая экономика", экологическая безопасность продуктов питания, питьевая вода и природные ресурсы Казахстана. Раздел будет полезен тем, кто интересуется современным состоянием экологии Казахстана, а также последними разработками ученых в данном направлении науки.  

Экономика

Научные статьи по экономике, менеджменту, маркетингу, бухгалтерскому учету, аудиту, оценке недвижимости и пр.

Этнология

Научные статьи по Этнологии опубликованные в Казахстане

Юриспруденция

Раздел посвящен государству и праву, юридической науке, современным проблемам международного права, обзору действующих законов Республики Казахстан Здесь опубликованы статьи из научных журналов и сборников по следующим темам: международное право, государственное право, уголовное право, гражданское право, а также основные тенденции развития национальной правовой системы.