Актуальность. Среди антропозоонозов эхинококкоз – довольно широко распространенное заболевание во многих районах Республики Казахстан. Согласно ветеринарной отчетности в РК степень зараженности животных составляет 25-67%. По данным литературы в Казахстане имеется тенденция ежегодного роста эхинококкоза человека начиная с 1989 года. Заболеваемость эхинококкозом в южных областях достигает до 12,5 на 100 тыс. населения, по городу Алматы 6,1 на 100 тыс. населения. Смертность людей от эхинококкоза составляет от 2,4 до 6,8%, инвалидность до 8,7%, рецидивы наблюдаются у 6,2-16,0% больных [1, 2, 3]. По частоте эхинококкоз в 50-73% случаев поражает печень, которая является первым «фильтром» для онкосферы паразита. Одним из наиболее тяжелых и опасных осложнений паразитарных заболеваний печени является вовлечение в патологический процесс билиарного дерева, которое встречается в 1,3-55% случаев [4, 5, 6] и при этом летальность достигает 4,2-8,1% [7]. Диагноз при перфорации эхинококковой кисты в желчные пути, когда требуется срочное оперативное вмешательство, клинически поставить чрезвычайно сложно в 79% наблюдается безжелтушная форма такого осложнения [8], а с помощью инструментальных методов – практически невозможно.
Цель исследования. Разработать способ получения иммунной сыворотки пригодной для получения эффективного антительного эритроцитарного диагностикума (ЭД) для индикации эхинококкового антигена (АГ) в желчи, а также качественно улучшить иммунодиагностику осложненного эхинококкоза печени.
Материал и методы: Наши неоднократные попытки приготовить эхинококковый антительный ЭД из антиэхинококковой сыворотки кролика были безуспешны, хотя титр антиэхинококковых антител, выявляемых в РПГА был достаточно высоким (до 1:25600). Известно, что эхинококковая жидкость является смесью паразитарных антигенов и антигенов хозяина паразита (сывороточные и тканевые), причем вторые являются достаточно мощными иммуногенами [9]. Поэтому у кролика, иммунизированного эхинококковой жидкостью, появляются антитела и к тем, и к другим антигенам. Из такой антисыворотки с высокой активностью антител разной специфичности приготовить антительный ЭД практически невозможно. Эти антитела в процессе сенсибилизации эритроцитов конкурируют с антиэхинококковыми антителами, что ведет к уменьшению числа противоэхинококковых антител на поверхности эритроцитов.
Общеизвестны основы иммунитета любое чужеродное живому организму вещество к антигенным детерминантам этого вещества появляются иммунокомпетентные клетки и через 6-7 дней В-лимфоциты начинают продуцировать антитела. Интенсивность синтеза антител не одинаковая, она зависит от многих факторов (иммуногенность, повторность введения и т.д.). Иммунокомпетентные клетки одной специфичности могут сохраняться длительное время (иногда несколько лет). На повторное введение антигена реакция иммунной системы происходит значительно быстрее и сильнее, т.к. иммунокомпетентные клетки данной специфичности находятся в организме и готовы к встрече с этим антигеном, это известный феномен “иммунологической памяти”.
Все эксперименты выполнены с соблюдением требований XI Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964г) в соответствии с Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985г). Методика экспериментов: вводили кролику в первых сериях иммунизации эхинококковую жидкость (ЭЖ) из эхинококковой кисты (ЭК) печени овцы, а через определенное время, когда антитела ко всем компонентам ЭЖ (паразитарным и непаразитарным) исчезнут, вводили ЭЖ из ЭК легкого крупного рогатого скота (КРС), поэтому у кролика вырабатываются антитела, прежде всего к тем антигенам, которые уже были в его организме и контактировали с иммунной системой, т.е. к общим антигенам первой и второй серии эхинококковой жидкости, а это и есть собственно паразитарные антигены. Сывороточные и тканевые антигены овцы и КРС разной специфичности, поэтому “клетки памяти” иммунной системы, появившиеся на введение сывороточных и тканевых (печеночных) компонентов овцы, не будут задействованы при повторном введении сывороточных и тканевых (легочных) антигенов КРС.
Нами отработана методика получения такой специфичной антиэхинококковой кроличьей сыворотки, из которой мы смогли приготовить антительный ЭД.
Проведена последовательная иммунизация кроликов ЭЖ, полученную из ЭК печени овцы и ЭЖ, полученной из ЭК легких КРС по следующей схеме. В первой серии иммунизации 6 кроликам 4 раза с интервалом 10-12 дней вводили ЭЖ, полученной из ЭК овцы, подкожно, в концентрации 20 мг/мл (1,0 мл) с адьювантом Фрейнда. Вторую серию иммунизации проводили через 4-5 месяцев путем однократного введения ЭЖ внутримышечно, в концентрации 20 мг/мл, 1,0 мл, полученной из ЭК легких КРС. Определение активности (титра) антител проводили при помощи РПГА с антигенным эхинококковым ЭД в сыворотке крови иммунизированных кроликов. Кровь для исследования брали до начала иммунизации, через 12 дней после первой серии иммунизации, за 10 минут до второй серии иммунизации и через 4-5 дней после второй серии иммунизации. Результаты исследования приведены в таблице 1.
Как видно, после первой серии иммунизации титр антител, специфичных к эхинококковому антигену, был всего в 1,8 раза больше, чем титр антител к тканевым антигенам, после второй же серии иммунизации титр антител к эхинококковым антигенам превысил титр антител к тканевым антигенам уже в 51,7 раза.
Таблица 1 Динамика титра антител к эхинококковым и тканевым антигенам при последовательной иммунизации кроликов эхинококковой жидкостью от овцы и крупного рогатого скота с разной локализацией паразита
Иммунизация |
Эхинококковая жидкость |
Средний геометрический титр в РПГА с ЭД из антигенов |
||
Титр неспецифических антител сыворотки овцы и печени овцы |
Титр неспецифических антител сыворотки к.р.с. и легкого к.р.с. |
Титр специфических антител эхинококка очищенного от тканевых компонентов |
||
Первая серия иммунизации, 4 инъекции |
Из эхинококковой кисты печени овцы |
14200 +1,2 1254 + 1,1 |
320 + 1,1 180 + 1,1 |
25600 + 1,2 |
До второй реиммунизации |
<100 |
<100 |
512+1,1 |
|
Вторая реиммунизация 1 инъекция |
Из эхинококковой кисты легкого к.р.с. |
<100 <100 |
240 + 1,2 <100 |
12800 + 1,2 |
Во второй серии иммунизации мы использовали антиген, специфичность которого по эхинококковому компоненту не различалась с антигеном, использованным в первой серии иммунизации, а тканевые компоненты в этих антигенах были различные (ввиду различной локализации эхинококка и видового различия хозяев паразита).
Поэтому в соответствии с феноменом «иммунологической памяти» антительный ответ на эхинококковые антигены шел по типу вторичного иммунного ответа (более короткий латентный период, более высокий титр и авидность антител) – на 4-5-ый день уже определялись высокие титры антиэхинококковых антител. Антительный ответ на тканевые антигены крупного рогатого скота после второй серии иммунизации развивался по типу первичного иммунного ответа и поэтому на 4-5-ый день титр этих антител был еще очень низким, а повторной стимуляции выработки антител к тканевым антигенам овцы не было, что, по-видимому, обусловлено малым содержанием в использованных ЭЖ перекрестных (между крупным рогатым скотом и овцой) антигенов.
По данным литературы индикация эхинококковых антигенов проводилась только при эхинококкозе легких осложненном перфорацией (в бронхиальных смывах) [10] и почек (в моче) [11]. Работ по индикации эхинококкового антигена в желчи при эхинококкозе печени осложненном перфорацией в желчные протоки в доступной литературе мы не нашли. В своей работе мы проводили индикацию эхинококкового антигена в порции С желчи больных в РПГА с иммуноглобулиновым диагностикумом [12]. После разрыва оболочек кисты и ее опорожнения, паразитарная киста еще длительное время (несколько недель) продолжает выделять специфические эхинококковые антигены, которые попадают в желчь. Нами был отработан режим индикации эхинококкового антигена в желчи.
Мы сравнивали эффективность диагностики осложненного эхинококкоза печени с помощью микроскопии желчи и разработанного нами способа. Всего было обследовано и прооперировано 18 больных эхинококкозом печени с подозрением на перфорацию в желчные протоки.
До операции желчь больных (порция С) исследовалась с целью выявления перфорации ЭК в желчные протоки. Диагноз эхинококкоз печени был подтвержден у всех больных. У 7 больных был установлен диагноз эхинококкоз печени осложненный перфорацией в желчные протоки. Результаты представлены в табл.2.
Только у одного больного при микроскопировании в порции С желчи были обнаружены единичные клетки паразита. У всех 7 больных в желчи был обнаружен эхинококковый антиген до оперативного вмешательства. Ни у одного больного с неосложненным эхинококкозом печени эхинококковый антиген в желчи не обнаружен.
Табл.2. Сравнительная эффективность диагностики осложненного перфорацией в желчные протоки эхинококкоза печени.
Количество больных |
Количество выявленных больных |
|
Метод |
||
микроскопирование |
индикации антигена в желчи |
|
7 больных (осложненный) |
1 |
7 |
11 больных (неосложненный) |
0 |
0 |
Таким образом, использование схемы последовательной иммунизации кроликов ЭЖ, полученной при различной локализации эхинококкоза у хозяев, относящихся к разным биологическим видам, позволило получить иммунную сыворотку с высоким содержанием антител, специфичных к эхинококковым антигенам, и низким содержанием антител, специфичных к тканевым антигенам. Разработан простой, специфичный и чувствительный способ диагностики эхинококкоза печени осложненного перфорацией в желчные протоки по индикации эхинококкового антигена в порции С желчи больных с помощью антительного эритроцитарного диагностикума в РПГА. Своевременная диагностика такого осложнения позволяет повысить эффективность оперативного лечения больных.
Выводы:
- Для получения высокоспецифичного антительного эритроцитарного диагностикума необходима последовательная иммунизация кроликов эхинококковой жидкостью полученной из кист с локализацией в разных органах гетерогенных животных.
- Применение высокоспецифичного эхинококкового антительного эритроцитарного диагностикума в клинической практике позволило до оперативного вмешательства диагностировать возникновение цистобилиарного свища и определить оптимальную тактику хирургического лечения эхинококкоза печени.
Авторы разработали способ получения иммунной сыворотки путем последовательной иммунизации кроликов эхинококковой жидкостью полученной из кист локализованных в разных органах гетерогенных животных. С помощью иммунной сыворотки приготовлен эффективный антительный эритроцитарный диагностикум для индикации эхинококкового антигена в желчи больных. 18 из них выполнялись исследование желчи на наличие эхинококкового антигена при осложненном эхинококкозе печени. В 7 случаях в желчи (порция С) обнаружен эхинококковый антиген, что свидетельствовало о прорыве эхинококковой кисты в билиарное дерево, это подтвердилось во время операции.
Авторы обосновывают целесообразность исследования желчи на наличие эхинококковых антигенов, что позволяет до операции верифицировать прорыв эхинококковой кисты в желчные пути и определить объем оперативного вмешательства. Метод требует дальнейшего изучения и внедрения в практическое здравоохранение.
Литература:
- Абдурахманов Е.А., «Хирургия эхинококкоза и альвеококкоза» , А-Ата 1981г., 136 стр.
- Алиев М.А., Ордабеков С.О. «Осложненный эхинококкоз брюшной полости», «Галым» Алматы, 1996, 218стр.
- Ордабеков С.О., Акшулаков С.К., Кулакеев О.К. «Эхинококкоз человека», Алматы, 2009, 512стр.
- Агаев P.M. Хирургическое лечение эхинококкоза печени и его осложнений // Хирургия. 2001. № 2. — С. 32-36.
- Насиров М.Я., Панахов Д.М., Ахмедов Г.Х. Пути улучшениярезультатов лечения эхинококкоза печени // Анналы хирургической гепатологии. 2002. т.7. №1. С. 23-26.
- Cucinotta E., Palmeri R., Lazzara S., Melita G., Melita P. Intrabiliary rupture of hepatic hydatid cyst. Chir Ital 2002; 54: 2: 249—252.
- Агаев P.M. Диагностика и хирургическое лечениеэхинококкоза печени с поражением желчных путей // Хирургия. -2002. № 9. С. 58-63.
- Назыров Ф.Г. и др. Хирургия эхинококковых кист печени с прорывом в желчные протоки //Эхинококкоз и очаговые заболевания паренхиматозных органов человека (Сб. научных трудов). Шымкент. 1998, с 85-87.
- Lightowlers M.W. Immunology and molecular biology of echinococcus infections // International Journal for Parasitology 1990, vol. 20, №4, р. 471-478.
- Рехтман А.Г., Пальгова Л.К. и др. Эндоскопическая и иммунологическая характеристика бронхов при эхинококкозе легкого //Эхинококкоз и очаговые заболевания паренхиматозных органов человека (Сб. научных трудов). Шымкент. 1998. С 110-112.
- Angulo J.C., Escribano J., Diego A., Sanchez C.M. Isolated retrovesical and retroperitoneal hydatidosis: clinical study of 10 cases and literature review. \\ J. Urol. 1998 Jan, 159:1б 76-82.
- Курмангалиев К.Б., Кузьмин Д.Ю. Совершенствование методов диагностики билиарных осложнений эхинококкоза печени // Мат-лы РНПК «Реформирование и развитие сельского здравоохранения в Республике Казахстан, Талдыкурган, 2005 с. 199-200