Применение антительного эхинококкового эритроцитарного диагностикума для диагностики цистобилиарного свища

Актуальность. Среди антропозоонозов эхинококкоз – довольно широко распространенное заболевание во многих районах Республики Казахстан. Согласно ветеринарной отчетности в РК степень зараженности животных составляет 25-67%. По данным литературы в Казахстане имеется тенденция ежегодного роста эхинококкоза человека начиная с 1989 года. Заболеваемость эхинококкозом в южных областях достигает до 12,5 на 100 тыс. населения, по городу Алматы 6,1 на 100 тыс. населения. Смертность людей от эхинококкоза составляет от 2,4 до 6,8%, инвалидность до 8,7%, рецидивы наблюдаются у 6,2-16,0% больных [1, 2, 3]. По частоте эхинококкоз в 50-73% случаев поражает печень, которая является первым «фильтром» для онкосферы паразита. Одним из наиболее тяжелых и опасных осложнений паразитарных заболеваний печени является вовлечение в патологический процесс билиарного дерева, которое встречается в 1,3-55% случаев [4, 5, 6] и при этом летальность достигает 4,2-8,1% [7]. Диагноз при перфорации эхинококковой кисты в желчные пути, когда требуется срочное оперативное вмешательство, клинически поставить чрезвычайно сложно в 79% наблюдается безжелтушная форма такого осложнения [8], а с помощью инструментальных методов – практически невозможно.

Цель исследования. Разработать способ получения иммунной сыворотки пригодной для получения эффективного антительного эритроцитарного диагностикума (ЭД) для индикации эхинококкового антигена (АГ) в желчи, а также качественно улучшить иммунодиагностику осложненного эхинококкоза печени.

Материал и методы: Наши неоднократные попытки приготовить эхинококковый антительный ЭД из антиэхинококковой сыворотки кролика были безуспешны, хотя титр антиэхинококковых антител, выявляемых в РПГА был достаточно высоким (до 1:25600). Известно, что эхинококковая жидкость является смесью паразитарных антигенов и антигенов хозяина паразита (сывороточные и тканевые), причем вторые являются достаточно мощными иммуногенами [9]. Поэтому у кролика, иммунизированного эхинококковой жидкостью, появляются антитела и к тем, и к другим антигенам. Из такой антисыворотки с высокой активностью антител разной специфичности приготовить антительный ЭД практически невозможно. Эти антитела в процессе сенсибилизации эритроцитов конкурируют с антиэхинококковыми антителами, что ведет к уменьшению числа противоэхинококковых антител на поверхности эритроцитов.

Общеизвестны основы иммунитета любое чужеродное живому организму вещество к антигенным детерминантам этого вещества появляются иммунокомпетентные клетки и через 6-7 дней В-лимфоциты начинают продуцировать антитела. Интенсивность синтеза антител не одинаковая, она зависит от многих факторов (иммуногенность, повторность введения и т.д.). Иммунокомпетентные клетки одной специфичности могут сохраняться длительное время (иногда несколько лет). На повторное введение антигена реакция иммунной системы происходит значительно быстрее и сильнее, т.к. иммунокомпетентные клетки данной специфичности находятся в организме и готовы к встрече с этим антигеном, это известный феномен “иммунологической памяти”.

Все эксперименты выполнены с соблюдением требований XI Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964г) в соответствии с Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985г). Методика экспериментов: вводили кролику в первых сериях иммунизации эхинококковую жидкость (ЭЖ) из эхинококковой кисты (ЭК) печени овцы, а через определенное время, когда антитела ко всем компонентам ЭЖ (паразитарным и непаразитарным) исчезнут, вводили ЭЖ из ЭК легкого крупного рогатого скота (КРС), поэтому у кролика вырабатываются антитела, прежде всего к тем антигенам, которые уже были в его организме и контактировали с иммунной системой, т.е. к общим антигенам первой и второй серии эхинококковой жидкости, а это и есть собственно паразитарные антигены. Сывороточные и тканевые антигены овцы и КРС разной специфичности, поэтому “клетки памяти” иммунной системы, появившиеся на введение сывороточных и тканевых (печеночных) компонентов овцы, не будут задействованы при повторном введении сывороточных и тканевых (легочных) антигенов КРС.

Нами отработана методика получения такой специфичной антиэхинококковой кроличьей сыворотки, из которой мы смогли приготовить антительный ЭД.

Проведена последовательная иммунизация кроликов ЭЖ, полученную из ЭК печени овцы и ЭЖ, полученной из ЭК легких КРС по следующей схеме. В первой серии иммунизации 6 кроликам 4 раза с интервалом 10-12 дней вводили ЭЖ, полученной из ЭК овцы, подкожно, в концентрации 20 мг/мл (1,0 мл) с адьювантом Фрейнда. Вторую серию иммунизации проводили через 4-5 месяцев путем однократного введения ЭЖ внутримышечно, в концентрации 20 мг/мл, 1,0 мл, полученной из ЭК легких КРС. Определение активности (титра) антител проводили при помощи РПГА с антигенным эхинококковым ЭД в сыворотке крови иммунизированных кроликов. Кровь для исследования брали до начала иммунизации, через 12 дней после первой серии иммунизации, за 10 минут до второй серии иммунизации и через 4-5 дней после второй серии иммунизации. Результаты исследования приведены в таблице 1.

Как видно, после первой серии иммунизации титр антител, специфичных к эхинококковому антигену, был всего в 1,8 раза больше, чем титр антител к тканевым антигенам, после второй же серии иммунизации титр антител к эхинококковым антигенам превысил титр антител к тканевым антигенам уже в 51,7 раза.

Таблица 1 Динамика титра антител к эхинококковым и тканевым антигенам при последовательной иммунизации кроликов эхинококковой жидкостью от овцы и крупного рогатого скота с разной локализацией паразита

Иммунизация

Эхинококковая жидкость

Средний геометрический титр в РПГА с ЭД из антигенов

Титр неспецифических антител сыворотки

овцы и печени овцы

Титр неспецифических антител сыворотки к.р.с. и легкого к.р.с.

Титр специфических антител эхинококка очищенного от тканевых компонентов

Первая серия иммунизации, 4

инъекции

Из эхинококковой кисты печени овцы

14200 +1,2

1254 + 1,1

320 + 1,1

180 + 1,1

25600 + 1,2

До второй

реиммунизации

 

<100

<100

512+1,1

Вторая реиммунизация 1 инъекция

Из эхинококковой кисты легкого к.р.с.

<100

<100

240 + 1,2

<100

12800 + 1,2

Во второй серии иммунизации мы использовали антиген, специфичность которого по эхинококковому компоненту не различалась с антигеном, использованным в первой серии иммунизации, а тканевые компоненты в этих антигенах были различные (ввиду различной локализации эхинококка и видового различия хозяев паразита).

Поэтому в соответствии с феноменом «иммунологической памяти» антительный ответ на эхинококковые антигены шел по типу вторичного иммунного ответа (более короткий латентный период, более высокий титр и авидность антител) – на 4-5-ый день уже определялись высокие титры антиэхинококковых антител. Антительный ответ на тканевые антигены крупного рогатого скота после второй серии иммунизации развивался по типу первичного иммунного ответа и поэтому на 4-5-ый день титр этих антител был еще очень низким, а повторной стимуляции выработки антител к тканевым антигенам овцы не было, что, по-видимому, обусловлено малым содержанием в использованных ЭЖ перекрестных (между крупным рогатым скотом и овцой) антигенов.

По данным литературы индикация эхинококковых антигенов проводилась только при эхинококкозе легких осложненном перфорацией (в бронхиальных смывах) [10] и почек (в моче) [11]. Работ по индикации эхинококкового антигена в желчи при эхинококкозе печени осложненном перфорацией в желчные протоки в доступной литературе мы не нашли. В своей работе мы проводили индикацию эхинококкового антигена в порции С желчи больных в РПГА с иммуноглобулиновым диагностикумом [12]. После разрыва оболочек кисты и ее опорожнения, паразитарная киста еще длительное время (несколько недель) продолжает выделять специфические эхинококковые антигены, которые попадают в желчь. Нами был отработан режим индикации эхинококкового антигена в желчи.

Мы сравнивали эффективность диагностики осложненного эхинококкоза печени с помощью микроскопии желчи и разработанного нами способа. Всего было обследовано и прооперировано 18 больных эхинококкозом печени с подозрением на перфорацию в желчные протоки.

До операции желчь больных (порция С) исследовалась с целью выявления перфорации ЭК в желчные протоки. Диагноз эхинококкоз печени был подтвержден у всех больных. У 7 больных был установлен диагноз эхинококкоз печени осложненный перфорацией в желчные протоки. Результаты представлены в табл.2.

Только у одного больного при микроскопировании в порции С желчи были обнаружены единичные клетки паразита. У всех 7 больных в желчи был обнаружен эхинококковый антиген до оперативного вмешательства. Ни у одного больного с неосложненным эхинококкозом печени эхинококковый антиген в желчи не обнаружен.

Табл.2. Сравнительная эффективность диагностики осложненного перфорацией в желчные протоки эхинококкоза печени.

Количество больных

Количество выявленных больных

Метод

микроскопирование

индикации антигена в желчи

7 больных (осложненный)

1

7

11 больных (неосложненный)

0

0

Таким образом, использование схемы последовательной иммунизации кроликов ЭЖ, полученной при различной локализации эхинококкоза у хозяев, относящихся к разным биологическим видам, позволило получить иммунную сыворотку с высоким содержанием антител, специфичных к эхинококковым антигенам, и низким содержанием антител, специфичных к тканевым антигенам. Разработан простой, специфичный и чувствительный способ диагностики эхинококкоза печени осложненного перфорацией в желчные протоки по индикации эхинококкового антигена в порции С желчи больных с помощью антительного эритроцитарного диагностикума в РПГА. Своевременная диагностика такого осложнения позволяет повысить эффективность оперативного лечения больных.

Выводы:

  1. Для получения высокоспецифичного антительного эритроцитарного диагностикума необходима последовательная иммунизация кроликов эхинококковой жидкостью полученной из кист с локализацией в разных органах гетерогенных животных.
  2. Применение высокоспецифичного эхинококкового антительного эритроцитарного диагностикума в клинической практике позволило до оперативного вмешательства диагностировать возникновение цистобилиарного свища и определить оптимальную тактику хирургического лечения эхинококкоза печени.

Авторы разработали способ получения иммунной сыворотки путем последовательной иммунизации кроликов эхинококковой жидкостью полученной из кист локализованных в разных органах гетерогенных животных. С помощью иммунной сыворотки приготовлен эффективный антительный эритроцитарный диагностикум для индикации эхинококкового антигена в желчи больных. 18 из них выполнялись исследование желчи на наличие эхинококкового антигена при осложненном эхинококкозе печени. В 7 случаях в желчи (порция С) обнаружен эхинококковый антиген, что свидетельствовало о прорыве эхинококковой кисты в билиарное дерево, это подтвердилось во время операции.

Авторы обосновывают целесообразность исследования желчи на наличие эхинококковых антигенов, что позволяет до операции верифицировать прорыв эхинококковой кисты в желчные пути и определить объем оперативного вмешательства. Метод требует дальнейшего изучения и внедрения в практическое здравоохранение.

 

Литература:

  1. Абдурахманов Е.А., «Хирургия эхинококкоза и альвеококкоза» , А-Ата 1981г.136 стр.
  2. Алиев М.А., Ордабеков С.О. «Осложненный эхинококкоз брюшной полости», «Галым» Алматы, 1996, 218стр.
  3. Ордабеков С.О., Акшулаков С.К., Кулакеев О.К. «Эхинококкоз человека», Алматы, 2009, 512стр.
  4. Агаев P.M. Хирургическое лечение эхинококкоза печени и его осложнений // Хирургия. 2001. № 2. — С. 32-36.
  5. Насиров М.Я., Панахов Д.М., Ахмедов Г.Х. Пути улучшениярезультатов лечения эхинококкоза печени // Анналы хирургической гепатологии. 2002. т.7. №1. С. 23-26.
  6. Cucinotta E.Palmeri R., Lazzara S., Melita G., Melita P. Intrabiliary rupture of hepatic hydatid cyst. Chir Ital 2002; 54: 2: 249—252.
  7. Агаев P.M. Диагностика и хирургическое лечениеэхинококкоза печени с поражением желчных путей // Хирургия. -2002. № 9. С. 58-63.
  8. Назыров Ф.Г. и др. Хирургия эхинококковых кист печени с прорывом в желчные протоки //Эхинококкоз и очаговые заболевания паренхиматозных органов человека (Сб. научных трудов). Шымкент. 1998, с 85-87.
  9. Lightowlers M.W. Immunology and molecular biology of echinococcus infections // International Journal for Parasitology 1990, vol. 20, №4, р. 471-478.
  10. Рехтман А.Г., Пальгова Л.К. и др. Эндоскопическая и иммунологическая характеристика бронхов при эхинококкозе легкого //Эхинококкоз и очаговые заболевания паренхиматозных органов человека (Сб. научных трудов). Шымкент. 1998. С 110-112.
  11. Angulo J.C., Escribano J.Diego A., Sanchez C.M. Isolated retrovesical and retroperitoneal hydatidosis: clinical study of 10 cases and literature review. \\ J. Urol. 1998 Jan, 159:1б 76-82.
  12. Курмангалиев К.Б., Кузьмин Д.Ю. Совершенствование методов диагностики билиарных осложнений эхинококкоза печени // Мат-лы РНПК «Реформирование и развитие сельского здравоохранения в Республике Казахстан, Талдыкурган, 2005 с. 199-200
Год: 2012
Город: Алматы
Категория: Медицина
loading...