Выращивание протосколексовдо стадии сегментации в условиях invitro

В статье приводится описание методики выращивания протосколексовinvitro до стадиипресегментации. Изучение этапов развития паразита представляетважное значение для изучения особенностей данного паразита в условиях invitro. В ходе данной работы представлены результаты по выращиванию протосколексовв течение 20 дней, что соответствует стадии PS 3. Для исследования применяли материал, собранный со скотобоен, расположенных в Алматинской области. При подготовке среды использовали методику, воспроизводящую среду тонкого отдела кишечника собак. В качестве активатора роста протосколексов была использована желчь собаки. Результаты проделанный работы свидетельствуют о перспективности исследований цестод в условиях invitro.

Введение: Эхинококкоз (Echinococcusgranulosus) - инвазионная болезнь плотоядных, сельскохозяйственных животных и человека. Окончательными хозяевами являются домашние и дикие плотоядные - собаки, волки, шакалы и др., в тонком отделе кишечника которых паразитирует половозрелая форма гельминта Echinococcusgranulosus. На сегодняшний день Республика Казахстан входит в число стран неблагополучных по эхинококкозу. Наиболее высокая частота встречаемости отмечается в Джамбульской, Алматинской, Южно-Казахстанской, Западно-Казахстанской области. В этих регионах зараженность животных достигает 20,4-47,13%, а показатели заболеваемости людей эхинококкозом (5,13-7,61 на 100 тысяч населения) превышают в несколько раз средние показатели, полученные в целом по республике [1]. Выращивание личиночных форм invitro позволяет исследовать эхинококкоз минуя угрозу заражения для персонала[2]. До настоящего момента в Казахстане не проводилось работ по выращиванию E.granulosusinvitro.

Целью исследования явилось изучение выращиванияпротосколексов в условиях invitro с получением особей пре-сегментарной стадии развития с описанием морфологии последних.

Материалы и методы: В работе использованы 15 эхинококковых цист, изолированных изпечени и легких овец и крупного рогатого скота на территории Алматинской области. После отбора, зараженные органы помещались в боксы для транспортировки. Сбор протосколексов проводили в стерильных условиях по стандартной методике [3]. Собранную гидатидную жидкость отстаивали в 50 mlFalcon пробирках. Жизнеспособность определяли с помощью микроскопии (х400) по наличию двигательной активности. Для культивирования использовались цисты, в которых более 80% протосколексов были подвижны.

Культивирование осуществляли на базе лаборатории паразитологии ТОО НПП «Антиген». Приготовление среды для выращивания протосколексовпроводили по методике, описаннойSmythetal. [4,5]. Среда для культивирования двухфазная – состояла из жидкой фазы (260 мл RPMI, 100 мл эмбриональная телячья сыворотка, 36 мл 5% экстракта дрожжей (в RPMI), 5,6 мл 30% глюкозы (в дистиллированной воде), 1,4 мл 5% собачьей желчи (в PBS), 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, 10 мМNaHCO3) и твердой фазы (сыворотка КРС, коагулированная на водяной бане при 76 ° С в течение 20-30 минут).Параллельно с таурохолатом натрия, который описан в оригинальной методике,для индукции развития протосколексов была использована собачья желчь, предварительно отфильтрованная (Millex-GV Filter, 0.22 µm). Культивирование проводилось во флаконах Falcon™ TissueCultureTreatedFlask, 50 ml. Инкубация осуществлялась при 3 70 С и 5% С〇2 в С〇2-инкубаторе. Смена среды проводилась каждые 4-8 дней [6].

Результаты:В процессе работы удалось добиться роста протосколексов до 3 стадии роста (Ps.3).

На рисунке 3 показан протосколекс спустя 8 дней после начала культивирования. Для данной стадии характерно начало формирования экскреторного канала. Активность паразита постепенно снижается.

На рисунке 4 показан протосколекс спустя 11 дней после начала культивирования. Характеризуется исчезновением известковых телец, латеральные экскреторные каналы хорошо визуализируются, присутствует генитальный рудимент, указывающий на формирование первой проглоттиды. Сужение ниже шейки обозначает место формирования сегмента.Развитие стадий протосколексов протекало неравномерно, в то время как одни достигли третьей стадии некоторые из протосколексов были только на первой.Не наблюдалось существенных различий при использовании таурохолата натрия и собачей желчи, при повторном выращивании была использована только собачья желчь.Процент выжившихпротосколексов, доросших до стадии составил 50%.

Обсуждение результатов: В процессе исследования удалось вырастить протосколексов до 3 стадии. Использование собачьей желчи, содержащей соли таурохолата, позволяет обойтись без использования дорогих коммерческих реагентов, кроме того следует учитывать ее доступность. Однако желчные кислоты содержат дезоксихолат натрия способный разрушать неодермис — синцитиальный эпителий, приводя тем самым к гибели протосколексов. Тем не менее в естественных условиях развитие последних происходит именно в таких условиях.

Выводы: Выращенные паразиты не продуцируют плодородных или зрелых яиц, соответственно нет никакого риска заражения для исследователей. Вышеописанный способ выращивания E. granulosus в культуральных средах может открыть новые возможности для исследования и работы над эхинококкозом, в частности, диагностики, способов защиты и лечения этого опасного паразитарного заболевания.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Рекомендации «Мероприятия по профилактике и девастации эхинококккоза в Республике Казахстан». - Алматы, 2015. - 26 с.
  2. Mohammadzadeh T. et al. Establishment of a modified in vitro cultivation of protoscoleces to adult Echinococcusgranulosus; an important way for new investigations on hydatidosis // Iranian journal of parasitology. - 2012. - Т.7. - №1. - С. 59-64.
  3. Smyth J. D. Studies on tapeworm physiology: XI. In vitro cultivation of Echinococcusgranulosus from the protoscolex to the strobilate stage // Parasitology. - 1967. - Т. 57., №1. - С. 111-133.
  4. Smyth J. D., Davies Z. In vitro culture of the strobilar stage of Echinococcusgranulosus (sheep strain): a review of basic problems and results // International Journal for Parasitology. - 1974. - Т.4., №6. - С. 631-644.
  5. Smyth JD. Cestoda. In: Smyth JD, editor. In vitro Cultivation of Parasitic Helminthes. - London: CRCpress, 1990. - 137 р.
  6. Dezaki E. S. et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcusgranulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms //Parasitology research. - 2016. - Т. 115, №11. - С. 4405-4416.
Год: 2018
Город: Алматы
Категория: Медицина