Пенициллинацилаза и ее роль в реакции синтеза полусинтетических антибиотиков

В данной статье описаны свойства фермента пенициллинацилазы и его применение в синтезе полусинтетических антибиотиков.

Актуальность проблемы: Одной из задач фармацевтической промышленности является обеспечение населения и лечебно-профилактических учреждений устойчивыми к микроорганизмам антибактериальными, эффективными и экономически доступными лекарственными препаратами. Одним из путей решения данной проблемы является изучение свойств ферментов, играющих главную роль при сборке антибиотического препарата. Если изменить ключевой фермент, то можно создать более сильные и адаптируемые под конкретные цели антибиотики из недорогих природных соединений.

Цель исследования. Изучение ферментативного пути получения полусинтетических антибиотиков с помощью пеницилинацилазы.

Введение. Пенициллинацилазы - ферменты, разрывающие ß-лактамное кольцо пенициллинов и цефалоспоринов. Синтезируются грамположительными (стрептококки, стафилококки) и некоторыми грамотрицательными (эшерихия коли, протей) бактериями.

Ферментативное расщепление беталактамного кольца ведет к полной инактивации ß-лактамного антибиотика. В настоящее время пенициллинацилазы составляют общирную группу одинаковых по механизму действия, но разнящихся по субстратной специфичности ферментов, объединённых под общим названием «ß-лактамазы». ß-лактамазы бывают как широкого спектра действия, расщепляющие пенициллины, так и узкого - активные в отношений только одной из групп этих антибиотиков. Пенициллинацилазы грамположительных микроорганизмов служат индуцируемыми ферментами, поэтому их синтез начинается только в момент контакта бактерии с β- лактамами. При этом пенициллинацилаза высвобождается из бактериальных клеток и инактивирует антибиотик в межклеточном пространстве.

В то же время ß-лактамазы грамотрицательных микроорганизмов детоксицирует антибиотик в периплазматическом пространстве. Таким образом они инактивируют проникшие через наружную мембрану ß-лактамы еще до того, как антибиотик связался с ферментами, участвующими в синтезе клеточной стенки.

Пенициллинацилазы резистентных грамотрицательных микроорганизмов синтезируются конститутивно и постоянно находятся в периплазматическом пространстве.

Иногда у одной клетки может оказаться две разных β- лактамазы, причем одна из них образуется постоянно, т.е. конститутивно, тогда как другая обнаруживается, когда клетка попадает в среду β- лактамными антибиотиками.

Результаты и их обсуждение

Потенциальное использование Escherichia coli в качестве исходного материала для получения фермента пенициллинацилазы дает нам возможность провести периодическое культивирование микроорганизмов на искусственных питательных средах с целью диагностики и изучения их в биотехнологических целях. Род Escherichia coli (семейство Enterobacteriaceae) по биохимическим свойствам рассматривает 11 видов возбудителей эшерихиозов. Из них наибольшее значение в патологии имеет вид Escherichia coli. По морфологическим признакам Escherichia coli - палочки среднего размера с закругленными концами, располагаются беспорядочно; не образуют спор; некоторые штаммы имеют микрокапсулу; подвижные, но встречаются и неподвижные варианты; грамотрицательные. На мясопептонном агаре образуются круглые, выпуклые, средней величины, полупрозрачные, бесцветные колонии, обладающие высокой ферментативной активностью, что и является одним из продуктов получения пенициллинацилазы [1-4].

Известно, что пенициллинацилаза (ПА), выделенная из культуры Escherichia coli, применяется в процессе синтеза новых полусинтетических ß-лактамных антибиотиков. Предварительно нами были проведены квантовохимические исследования процессов её получения и катализируемые ею процессы получения новых беталактамидов [5-7].

Для культивирования и выделения Escherichia coli использовались разные питательные среды: обычные среды, дифференциально-диагностические среды. В качестве обычной среды для культивирования микроорганизма использовали мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ). Дифференциально-диагностические среды (среда Эндо, среда Китта-Тароцци) применяли для изучения биохимических свойств и дифференцировки одного вида культуры от другого, по характеру их ферментативной активности.

Питательная среда с МПА подвергается качественному и количественному контролю с использованием музейных штаммов в соответствии с действующими НТД. Музейные штаммы микроорганизмов приобретены в Институте Микробиологии РК.

Питательную среду разливали в чистую посуду и стерилизовали. Среду стерилизовали автоклавированием при определенном режиме. Для контроля стерильности после стерилизации среды помещали в термостат при 37 0С на 5 суток. Кроме контроля стерильности производили химический контроль нескольких образцов каждой серии готовой среды на рН, количество общего и аминного азота и хлоридов.

Идентификацию выделенных бактериальных клеток проводили путем изучения морфологии бактерий, их культуральных, биохимических и других признаков, присущих виду. Под культуральными признаками подразумеваются характер роста на плотных питательных средах. Различаются колонии по величине, форме, цвету, консистенции, контуру края, структуре и характеру поверхности. Для определения способности микроорганизмов ферментировать углеводы (биохимические признаки, т.е. сахаролитические свойства) используют короткий и длинный пестрый ряд. К первому относятся жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами: глюкозой, лактозой и с шестиатомным спиртом - маннитом. В посевах в пептонную воду определяли продукты расщепления пептона после инкубирования в течение 2-3 сут при температуре 37 0С путем постановки реакции на аммиак, на индол, на сероводород, реакции на обнаружение каталазы. Реакции подтверждались, что являлось доказательством подтверждения идентификации культуры Escherichia coli.

Последующим этапом наших исследований являлось получение фермента экстракта пенициллинацилазы из поверхностной культуры Escherichia coli. С этой целью была взята готовая поверхностная культура Escherichia coli влажностью 10-12% двух или трех продуцентов ферментов.

Полученный экстракт из поверхностной культуры содержит значительное количество мутной взвеси. Профильтровав его при частоте вращения 5000 мин-1, проводили несколько раз декантацию от осадка. Проводили анализ экстракта на определение содержания редуцирующих веществ, белка, золы, активности фермента.

Одним из исходных веществ для химического синтеза ß-лактамных антибиотиков является ядро природного пенициллина, катализируемого ПА. Химический синтез ß-лактамных антибиотиков включает в себя большое количество стадий (защита боковой цепи в 6 положении, активация карбоксильной группы, реакция ацилирования ядра ß-лактамного антибиотика различными ацилирующими агентами), которые проводятся в органическом растворителе.

Изучение закономерностей реакции ферментативного переноса ацильной группы на 6- АПК, выступающего в роли нуклеофила, на примере синтеза полусинтетического ß-лактамного антибиотика, катализируемого пенициллинацилазой и создание математической модели, адекватно описывающей данный процесс; выбор оптимальных условий синтеза нового соединения, катализируемого пенициллинацилазой, будут являться дальнейшими стадиями проведенных исследований. Работы в этом направлении продолжаются.

Выводы. Таким образом, изучен процесс получения фермента экстракта пенициллинацилазы из поверхностной культуры Escherichia coli. В присутствии полученного фермента в дальнейшем предполагается каталитический синтез нового ß- лактамного антибиотика. В практических исследованиях

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

  1. Ясная А.С. , Ямскова О.В., Гуранда Д.Ф., Щербакова Т.А. , Тишков В.И., Швядас В.К. Клонирование пенициллинацилазы из Escherichia coli. Каталитические свойства рекомбинантных ферментов // Вестник московского университета. //Химия. - 2008. - № 2. - С. 127-133.
  2. Алешукина А.В. Медицинская микробиология: Учебное пособие. - Ростов-на-Дону: Феникс, 2003. - 480 с.
  3. 3 Yang L., Wei D., Xu E., Lu G. Kinetically controlled synthesis of cefaclor using penicillin G acylase // J. Molecul. Catalysis. - 2003. - № 17. - P. 81-87.
  4. Nys P.S., Kurochkina V.B. Methodological approach to development of enzymatic technologies for semisynthetic betalactam antibiotic production // Appl. Biotechnol. Part A. Enzyme Eng Biotehnol. - 2000. - V. 88. - P. 221-229.
  5. Омарова Р.А., Бошкаева А.К., Искакова М.К. Молекулярное моделирование и скрининг реакционной способности ацилирующих агентов в системах 6-аминопенициллановая кислота-ацилирующие агенты // Материалы международной научно-практической конференции «Инновационные технологии в образовательном процессе: интеграция фармацевтической науки и практики», посвященная 60-летию фармацевтического факультета КазНМУ им. С.Д. Асфендиярова в рамках «Дни университета». 3 декабря 2011 г. - Алматы: 2011. - С.100-104.
  6. Омарова Р.А., Бошкаева А.К., Абдуллин К.А., Нокербек Ш. Квантово-химические особенности электронного и геометрического строения 6-аминопенициллановой кислоты, хлористого ацетила и продукта их взаимодействия, обладающего антибиотическим действием // Материалы Международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства. - Шымкент: 2009. - С. 138-140.
  7. Омарова Р.А., Бошкаева А.К., Абдуллин К.А., Нокербек Ш. Геометрические и электронные параметры молекулы 6- аминопенициллановой кислоты по данным квантово-химического расчета // Труды Международной научной конференции «Наука и образование - ведущий фактор стратегии «Казахстан - 2030»».2 3-24 июня 2009 г. - Караганда: 2009. - С. 403-405.
Год: 2014
Город: Алматы
Категория: Медицина