Противотуберкулезная активность продуктов пчеловодства в опыте in vivo

В статье приведены результаты доклинических исследований эффективности спиртового бальзама на основе продуктов пчеловодства в сравнении и в комплексе с классическими противотуберкулезными препаратами основного ряда при лечении экспериментального туберкулеза морских свинок, зараженных чувствительным музейным штаммом микобактерии (H37RV). Эксперимент проводился на базе референс-лаборатории Национального научного центра фтизиопульмонологии РК (г. Алматы) согласно методическим указаниям по изучению противотуберкулезной активности фармакологических веществ и их химиотерапевтической эффективности в опытах in vivo. Установлено, что использование спиртового бальзама в монотерапии не приводит к полному излечению, но способствует сдерживанию размножения бактериальной популяции в организме. При одновременном применении двух противотуберкулезных препаратов (изониозид и рифампицин) и спиртового бальзама на основе продуктов пчеловодства к концу опыта увеличивалась масса тела животных. Патоморфологические и гистологические исследования внутренних органов морских свинок, получавших лечение спиртовым бальзамом в комплексе с противотуберкулезными препаратами первого ряда, показали, что у них очагов туберкулезного воспаления на 12,5 % меньше, чем у экспериментальных животных, леченных только противотуберкулезными препаратами. Также в этой группе отмечено отсутствие гигантоклеточно- многоядерной инфильтрации в легких и центрального творожистого некроза в лимфоузлах и селезенке, наблюдались репарация и регенерация паренхимы и стромы исследованных органов.

Введение

Сегодня, когда современная наука достигла значительных результатов в различных областях, туберкулез (ТБ) продолжает оставаться большой проблемой мирового здравоохранения [1].

Составление новых комбинаций и схем лечения на основе известных противотуберкулезных препаратов (ПТП), разработка новых химиотерапевтических средств, включение в терапию дополнительных физиопроцедур и/или препаратов не всегда позволяют добиться нужного терапевтического эффекта. Причиной тому является высокая устойчивость микобактерий туберкулеза (МБТ) к различным воздействиям, обусловленная особенностями строения защитной оболочки патогена, содержащей воскоподобные вещества.

В связи с этим еще одним направлением, в котором ведутся исследования, в том числе и авторами данной статьи, является разработка препаратов, снижающих резистентность МБТ за счет разрушения и/или изменения структуры их защитной оболочки.

Принципиально новый класс исходного биологически активного сырья с точки зрения снижения устойчивости МБТ к лекарственным средствам представляют личинки большой восковой моли (ЛБВМ). Это нетрадиционный продукт пчеловодства.

Большая восковая моль (Galleria mellonella) паразитирует в пчелиной семье. Личинки G. mellonella, основным элементом питания которых является воск, усваивают до 50 % содержащихся в нем продуктов. Они могут переваривать мирициловый эфир пальмитиновой кислоты и имеют такие специфические липазы, которых нет у других насекомых. [2]. Следовательно, это единственное насекомое, личинки которого могут переваривать воск, входящий в состав оболочки возбудителя туберкулеза [3].

Как объект для исследований ЛБВМ известны во всем мире. В странах СНГ в настоящее время ЛБВМ используются для производства препаратов различной терапевтической направленности. За рубежом ЛБВМ преимущественно используются в качестве модели и альтернативного хозяина для исследования фактора вирулентности различных патогенов и изучения иммунного ответа инфицированных бактериями личинок, так как система ЛБВМ функционально аналогична иммунной системе млекопитающих и обладает как гуморальным, так и клеточным иммунитетом [4].

Аналогичные опыты непосредственно с возбудителем ТБ в начале 20 века проводил российский ученый С.И. Метальников. Он вводил личинкам в полость тела различные дозы МБТ. Инфицированные личинки не погибали, а продолжали свое развитие, превращаясь во взрослое насекомое. При исследовании крови и внутренних органов ЛБВМ было установлено, что фагоциты личинок быстро захватывают и переваривают МБТ. И даже при введении большого количества МБТ уже через 2–3 суток они разрушаются, а зараженные личинки совершенно здоровы [5]. Это дало возможность предполагать, что препараты ЛБВМ обладают такими же свойствами.

Главным фактором патогенности МБТ является токсический гликолипид (корд-фактор), который располагается на поверхности и в толще клеточной стенки. По химической природе он представляет собой полимер, состоящий из одной молекулы дисахарида трегалозы и связанных с ней в эквивалентных соотношениях миколовой и миколиновой высокомолекулярных жирных кислот, а также фтиоцеролдимикоцерозатов. Корд-фактор оказывает токсическое действие на ткани и защищает МБТ от фагоцитоза, блокируя окислительное фосфорилирование в митохондриях макрофагов.

M. tuberculosis, лишенные корд-фактора, являются непатогенными или слабопатогенными для человека и морских свинок [6].

Окрашивание нейтральным красным ослабленного в лабораторных условиях клинического изо- лята M. tuberculosis и непатогенных для морских свинок МБТ различного происхождения, выделенных из окружающей среды, дает отрицательную реакцию. Анализ липидов показал, что эти МБТ утратили способность синтезировать фтиоцеролдимикоцерозаты и другие клеточные липиды с разветвленной цепью, являющиеся основными факторами вирулентности M. tuberculosis, особенно на ранней стадии инфекции. Таким образом, отрицательная реакция при окрашивании является маркером вирулентности, указывает на важные нарушения в оболочке M. tuberculosis и снижение ее устойчивости к лекарственным средствам [7].

Вирулентный штамм M. tuberculosis, обработанный липидолитическими ферментами личинок G. melonella, при окрашивании по Цилю-Нильсену становится менее кислотоустойчивым, а окрашивание нейтральным красным дает отрицательную реакцию, что говорит о влиянии препаратов ЛБВМ на оболочку МБТ. При этом останавливается или сильно замедляется рост МБТ, они временно теряют свою вирулентность, о чем свидетельствуют биологические пробы на морских свинках [8].

У экспериментальных морских свинок, которым интраперитонеально вводили в разовой дозе 100 000 000 бактерий, инкубированных при 37 °C в течение 18 часов в непереработанных препаратах липазы и/или эстеразы, выделенных из ЛБВМ, туберкулезный процесс существенно регрессировал, и в течение семи недель после инокуляции видимой патологии не отмечалось, тогда как контрольные животные умерли на седьмой неделе. Однако бактерицидную активность препараты не проявляли, и у опытных морских свинок на восьмой неделе после заражения наблюдалось начало туберкулезного процесса [9].

При изучении свойств экстракта из G. mellonella с целью выделения фактора, ответственного за противотуберкулезную активность, было установлено, что липолитические и антибактериальные свойства обеспечивает белковая составляющая экстракта, в том числе и липазы, способные разрушать отдельные жизненно важные для микобактерий липиды и другие видоспецифические молекулы липидного слоя клеточной стенки [10].

Таким образом, даже после непродолжительного воздействия препаратами ЛБВМ микобактерии становятся авирулентными и более уязвимыми.

В результате научных исследований, проводимых научными сотрудниками Восточно-Казахстанского государственного технического университета им. Д. Серикбаева (ВКГТУ, г. Усть-Каменогорск) в рамках отечественного гранта, в 2015–2017 гг. были разработаны новые биологически активные добавки (БАД) «Спиртовый бальзам» и «Медовый бальзам» на основе продуктов пчеловодства и ЛБВМ для профилактики и комплексного лечения туберкулеза. На препараты разработаны и утверждены стандарты предприятия, поданы заявки на изобретения.

В 2016 г. было проведено экспериментальное изучение in vitro противотуберкулезной активности БАД «Спиртовый бальзам» на основе продуктов пчеловодства, содержащего этиловый спирт не более 20 %, в сравнении и в сочетании с ПТП в отношении музейного штамма (T37RV) Mycobacterium tuberculosis. В результате исследований было установлено, что одновременное добавление в питательную среду к ПТП первого и второго рядов различных разведений «Спиртового бальзама» на основе продуктов пчеловодства усиливает их бактерицидное действие и в 100 % случаев в более ранние сроки подавляет рост лекарственно-чувствительных и устойчивых штаммов МБТ.

Следующим этапом доклинических исследований согласно методике стало изучение химиотерапевтической эффективности спиртового бальзама на модели экспериментальной туберкулезной инфекции.

Цель нашего исследования — определить эффективность лечения зараженных музейным штаммом микобактерии (437RV) морских свинок спиртовым бальзамом на основе продуктов пчеловодства в сравнении и в комплексе с классическими противотуберкулезными препаратами.

Материалы и методика исследований

Эксперимент проводился в 2017 г. на базе референс-лаборатории Национального научного центра фтизиопульмонологии РК (г. Алматы) согласно методическим указаниям по изучению противотуберкулезной активности фармакологических веществ и изучению их химиотерапевтической эффективности в опытах in vivo [11]. Экспериментальное исследование было выполнено на 26 морских свинках весом 250-300 г, которые содержались в одинаковых условиях и однотипном пищевом рационе на протяжении всего эксперимента.

Для получения экспериментальной модели туберкулезного процесса животных заражали подкожным введением в правую паховую область 0,1 мг двухнедельного чувствительного штамма

M. tuberculosis H37RV. Для этого двухнедельную культуру выбранных для заражения штаммов снимали с косяка плотной среды, затем готовили бактериальную суспензию по 5-му стандарту оптической плотности. Титр полученной суспензии — 5×106 микробных тел в 1 мл. Исходную суспензию разводили в 10 раз и получили титр — 5×107 микробных тел в 1 мл. К 4 мл полученной суспензии добавляли 1 мл физиологического раствора с целью получения суспензии титром 4×107 микробных тел в 1 мл. Согласно методике весь эксперимент подразделялся на контроль и опыт (табл. 1).

Таблица 1

Схема опыта по изучения противотуберкулезной активности спиртового бальзама

Группа

Кол-во животных

Лечение

Контроль

1-я контрольная

8 (из них 2 для эвтаназии до лечения)

Без лечения

2-я контрольная

6

Изониазид (Н) в дозе 10 мкг/кг и рифампицин (R) в дозе 15 мг/кг

Опыт

1-я опытная

6

Изониазид в дозе 10 мкг/кг, рифампицин в дозе

15 мг/кг и бальзам по одной чайной ложке 3 раза в день

2-я опытная

6

Бальзам по одной чайной ложке 3 раза в день

Лечение животных начинали после развития туберкулезного процесса, который оценивался по общему состоянию животных (снижение активности, затрудненное дыхание, снижение массы). Для установления факта получения модели туберкулезной инфекции через 24 дня проводили эвтаназию с помощью эфирного наркоза двух особей из первой контрольной группы зараженных животных.

У животных при вскрытии визуально обнаруживались очаги туберкулезного воспаления. Из гомогенатов паренхиматозных органов высевались М. tuberculosis. Гистологическое и микробиологическое исследования, подтвердившие развитие туберкулезного процесса в печени и в месте заражения, послужили основанием для начала лечения животных.

Эффективность лечения определяли по продолжительности жизни животных, разнице в массе тела животных в начале и конце опыта, наличию специфических изменений в паренхиматозных органах, индексу высеваемости, индексу поражения.

При расчете средней продолжительности жизни лабораторных животных учитывали срок гибели каждого животного в группе. После гибели всех животных или по окончании опыта среднюю продолжительность жизни в контрольной и опытной группах рассчитывали как среднеарифметическое значение по формуле (дней):

Пср

п1+п2+п3+п4+п5+п6

,

(1)

где n1n2 и т.д. — продолжительность жизни каждой морской свинки в группе; 6 — количество морских свинок в группе.

Индекс высеваемости микобактерий туберкулеза определяли как среднее от общего количества колониеобразующих единиц на каждую группу. Кусочки внутренних органов каждого животного растирали в фарфоровой ступке, заливали 5 мл 6 %-ного раствора серной кислоты, гомогенизировали. Полученную массу центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об./мин. Время контакта микобактерий туберкулеза с серной кислотой не превышало 15-20 мин. Серную кислоту сливали, осадок дважды отмывали 0,9 %-ным раствором №€.’1 и засевали в 5 пробирок с плотной яичной средой Ле- венштейна-Йенсена. Пробирки с посевами инкубировали в термостате при 37 ºС в течение 10-12 недель [11].

Интенсивность роста культуры учитывалась по четырехбалльной системе [11]:

  • 1-3 колонии на 1 косяке с плотной яичной средой +/- (0);
  • 4-10 колоний на 1 косяке с плотной яичной средой + (1);
  • 11-30 колоний на 1 косяке с плотной яичной средой ++ (2);
  • 31-100 колоний на 1 косяке с плотной яичной средой +++ (3);
  • сплошной рост колонии на 1 косяке с плотной средой ++++ (4).

 

Результаты

исследований

Проведенные наблюдения развития туберкулезного процесса в 1-й контрольной группе показали, что животные этой группы наиболее тяжело перенесли заражение. Хотя среди животных этой группы в ходе эксперимента не было отмечено гибели животных (средняя продолжительность жизни составила 75 дней), тем не менее у всех животных выявлялись все макроскопические и микроскопические признаки заболевания: вес животных снизился на 82,9±2,1 г (табл. 2), все животные были вялыми, их шерстка была тусклой. Они неохотно употребляли пищу. Образовался дефект кожи 3×5 мм, отмечен свищ с казеозом.

При вскрытии отмечалось полнокровие внутренних органов, на поверхности легких, печени и селезенки отмечались многочисленные серовато-желтые бугорки, местами сливающиеся друг с другом (рис. 1).

Правые паховые лимфоузлы были значительно увеличены в размерах, на разрезе у них, как правило, выделялся сливкообразный гной. Средняя величина индекса пораженности внутренних органов составила 4+ (табл. 3).

Таблица 3

Показатели эффективности лечения морских свинок противотуберкулезными препаратами первого ряда в комплексе со спиртовым бальзамом

Группа

Индекс поражения

Эффективность режима химиотерапии (индекс эффективности), %

1-я контрольная — без лечения

++++

Без лечения

2-я контрольная — HR

0

100

1-я опытная — HR+бальзам

0

100

2-я опытная — бальзам

+++

25

При гистологическом исследовании внутренних органов у животных этой группы было исследовано 24 фрагмента (по 6 гистологических блоков из печени, легких, селезенки и лимфатического узла).

Патоморфология внутренних органов в 100 % случаев выявила наличие туберкулезных бугорков во внутренних органах с различной тканевой реакцией. В паренхиматозных органах было обнаружено специфическое воспаление с распадом и деструкцией ткани преимущественно в легких, печени и селезенке (рис. 1). Казеозно-некротические массы в данной группе были представлены центральным творожистым некрозом с ограниченными грануляциями, которые инфильтрированы лимфоцитами, эпителиоидными клетками и гигантскими многоядерными типа Лангханса, фибробластами, плазмоцитами.

В некоторых очагах распад встречался и в толще волокон грануляционной ткани пахового лимфоузла с обеднением лимфоидной ткани и макрофагально-гистиоцитарными гранулемами. В легочной ткани наряду с туберкулезным воспалением пролиферативного типа имелись умеренные дисате- лектазы и интерстициальные утолщения альвеолярных перегородок.

Помимо гистологического было проведено микробиологическое подтверждение наличия туберкулезного процесса у морских свинок. Посев и микроскопия органов у животных этой группы показали обильный рост микобактерий туберкулеза (3+) из всех проб.

При оценке результатов лечения животных 2-й контрольной группы было обнаружено, что использование противотуберкулезных препаратов основного ряда (изониазида, рифампицина) привело к их полному излечению. Все зараженные животные дожили до конца эксперимента, средняя продолжительность их жизни составила 75 дней. Произошло снижение веса на 11,6±1,9 г (4,0 %). Дефект кожи на месте заражения у животных закрылся к концу первого месяца с образованием рубца. При забое животных этой группы визуально не было обнаружено признаков поражения внутренних органов. Легкие, печень, селезенка были обычного размера.

На гистологическое исследование было взято по одному фрагменту с каждого органа у 6 животных, что составляет 24 парафиновых блока. Патогистология указывает на наличие туберкулезных очагов преимущественно в лимфоузле и селезенке в половине случаев (в 3 из 6 наблюдений в каждом органе). Туберкулезные гранулемы характеризовались различной тканевой реакцией, начиная от альтерации и заканчивая фазами пролиферации, и местами подвергаясь слиянию. Гигантоклеточная реакция представлена умеренно (1-2 в одном поле зрения). В 30 % случаев изменения носили неспецифический характер, что свидетельствует о действии противотуберкулезных препаратов на МБТ и рассасывании туберкулезных гранулем.

В печени воспаление локализовалось преимущественно в перипортальных трактах и сопровождалось интенсивной гигантоклеточной реакцией с выраженной лимфо-плазмоцитарной инфильтрацией по периферии. Было зафиксировано 2 туберкулезных очага. В легочной ткани, как и в печени, 2 очага туберкулеза, интенсивной экссудации обнаружено не было, и воспаление носило преимущественно продуктивный тип. Альвеолы местами были ателектазированы, но в целом воздушность паренхимы сохранена.

Общее количество очагов туберкулеза составляет 10 из 24 фрагментов внутренних органов (41,7 %).

У животных 1-й опытной группы, в лечении которых использовали изониазид, рифампицин и спиртовый бальзам, были получены схожие результаты с группой, которых лечили только изониазидом и рифампицином. Из 6 экспериментальных животных этой группы до конца эксперимента пали трое (на 45, 47 и 50-е сутки). Средняя продолжительность жизни в этой группе составила 59±7,0 суток. Несмотря на падеж животных, они были упитанными, вес увеличился на 48,4±1,6 г, что существенно больше, чем в контрольных группах (табл. 2). При хороших результатах животные не доживали до конца эксперимента. Это объясняется неохотным приемом спиртового бальзама морскими свинками и возникновением у них жировой дистрофии гепатоцитов вследствие алкогольной интоксикации организма.

В данной группе всего было найдено 7 фокусов туберкулезного воспаления из 24 фрагментов внутренних органов (29,2 %), 2 очага в ткани печени, 1 участок в легком. Также выявлено по 2 фокуса в лимфоузле и селезенке, соответственно. В данной группе выражена пролиферативная тканевая реакция, которая характеризовалась отсутствием центрального творожистого некроза среди сливающихся эпителиоидно-макрофагальных гранулем (рис. 2). Локализация воспаления была центрилобу- лярно в печени и в мозговом слое лимфоузле.

В селезенке локализация наблюдалась преимущественно в мальпигиевых тельцах лимфатических узелков. В паренхиме легких гранулематозное воспаление охватывало перибронхиальные пространства и интерстиции без гигантоклеточно-многоядерной инфильтрации. Лимфоплазмоцитарная локализация по периферии и очаговое полнокровие представлены умеренно.

Особый интерес представляли результаты лечения экспериментальных животных 2-й опытной группы, в лечении которых использовали только спиртовый бальзам. Из 6 морских свинок пали пятеро, до конца дожила только одна морская свинка. Средняя продолжительность жизни в этой группе составила 61±11,1 день.

В данной группе у животных отмечались явные признаки заболевания: морские свинки были более вялыми, истощенными, их вес, как и в 1-й контрольной группе, значительно снизился, на 82±2,4 г (27,4 %). На вскрытии у всех животных во внутренних органах обнаружены патологические изменения, на поверхности печени у трех морских свинок выявлялись единичные мелкие бугорки сероватожелтого цвета, без тенденции к слиянию, в легких были единичные мелкие очаги. У остальных трех животных в печени, селезенке и легких очаги поражения отмечались по всей поверхности органов. Индекс пораженности внутренних органов на 3+.

При морфологическом и гистологическом исследованиях данной группы обнаружены множество очагов туберкулезного воспаления во всех органах (100 %), выраженная гигантоклеточная тканевая реакция, альтеративный тип воспаления в виде гомогенных некротических масс. Для данной группы было характерно наличие параспецифических реакций, в частности, очаговая паренхиматозная дистрофия гепатоцитов и локальные дисателектазы легочных альвеол. В печени обнаружены признаки жировой дистрофии гепатоцитов.

В лимфоузле гранулемы локализовались в паракортикальной зоне, в ткани селезенки гранулема обнаружена в перисинусоидальном пространстве красной пульпы. В целом гистоархитектоника внутренних органов частично стерта вследствие наличия репаративных процессов и появления оформленной грануляционной ткани с полнокровием сосудов микроциркуляторного русла.

Выводы

Изучив показатели эффективности лечения и результаты микроскопии всех представленных выше групп животных, можно сделать заключение: основным критерием оценки эффективности противотуберкулезных препаратов является количество очагов туберкулезного воспаления, верифици-

124

Вестник Карагандинского университета

руемых гистологически во внутренних органах экспериментальных животных, и наличие в тканях специфических для туберкулеза изменений.

Установлено, что в 1-й контрольной группе (без лечения) во всех 24-х фрагментах тканей изучаемых органов гистологически был обнаружен типичный туберкулез с различными фазами воспаления, протекавший по типу острой генерализованно-гематогенной диссеминации с очагами обсеменения по внутренним органам.

Доказано, что проведение монотерапии с использованием спиртового бальзама в лечении животных, больных туберкулезом с сохраненной чувствительностью, способствует сдерживанию размножения бактериальной популяции в организме, но не приводит к полному излечению.

Экспериментально доказано, что использование для лечения лабораторных животных спиртового бальзама в комплексе с противотуберкулезными препаратами основного ряда не останавливало туберкулезный процесс, но значительно ограничивало его развитие. Патоморфологические и гистологические исследования внутренних органов морских свинок, получавших лечение спиртовым бальзамом в комплексе с ПТП первого ряда, показали, что у них очагов туберкулезного воспаления на 12,5 % меньше, чем у экспериментальных животных, леченных только противотуберкулезными препаратами. Также в этой группе отмечено отсутствие гигантоклеточно-многоядерной инфильтрации в легких и центрального творожистого некроза в лимфоузлах и селезенке, наблюдались репарация и регенерация паренхимы и стромы исследованных органов.

Таким образом, в результате эксперимента доказана эффективность и целесообразность применения препаратов на основе продуктов пчеловодства в комплексной терапии туберкулеза человека. Во избежание нежелательных изменений и реакций организма в ходе лечения необходимо разработать и применять не содержащую спирт, удобную для хранения и применения лекарственную форму.

 

Список литературы

  1. Global tuberculosis report 2016: WHO/HTM/TB/2016.13. Geneva: World Health Organization, 2016.
  2. Тыщенко В.П. Физиология насекомых: учеб. пособие для студ. ун-тов, обуч. по спец. «Биология» / В.П. Тыщенко. — М.: Высш. шк., 1986. — 303 с.: ил.
  3. Ульянич Н.В. Целебные личинки восковой моли / Н.В. Ульянич // Пчеловодство. — 2015. — № 8. — С. 56-57.
  4. Loh J.M. Galleria mellonella larvae as an infection model for group A streptococcus / J.M. Loh, N. Adenwalla, S. Wiles, T. Proft // Virulence. — 2013. — Vol. 4. — P. 419-428.
  5. Метальников С.И. Проблема туберкулеза. Новые пути в изучении туберкулеза / С.И. Метальников // Современные записки. — 1921. — Кн. III. — С. 239-248.
  6. Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учебник для мед. вузов. — 5-e изд., испр. и доп. / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. — СПб.: СпецЛит, 2010. — 760 с.: ил.
  7. Cardona P.J. Neutral-red reaction is related to virulence and cell wall methyl-branched lipids in Mycobacterium tuberculosis / P.J. Cardona, C.Y. Soto, C. Martin, B. Giquel, G. Agusti, E. Guirado, T. Sirakova, P. Kolattukudy, E. Julian, M. Luquin // Microbes and Infection. — 2006. — Vol. 8, Iss. 11. — P. 183-190.
  8. Mankiewicz E. The action of lipidolytic enzymes of larvae of Galleria melonella on virulent Mycobacterium tuberculosis / E. Mankiewicz // Can. J. Med. Sci. — 1952. — Vol. 30, No. 1. — P. 106-112.
  9. Анненков Г. А. О возможности применения природных липаз и эстераз для ингибирования Mycobacterium tuberculosis / Г.А. Анненков, H.H. Клепиков, Л.П. Мартынова, В.А. Пузанов // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2004. — № 6. — С. 52-56.
  10. Останина, Е.С. Технология переработки восковой моли, изучение противотуберкулезных свойств хитозана и взаимодействия с липолитическими ферментами: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.23 / Екатерина Сергеевна Останина. — Щёлково, 2007. — 142 с.: ил.
  11. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общ. ред. Р.У. Хабриева. — 2-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 2005. — С. 571-579.
Год: 2018
Город: Караганда
Категория: Медицина