В статье отражены гистологические и электронно-микроскопические особенности структурной и функциональной организации отделов женской половой системы (желточников и тельца Мелиса) трематоды Parastrigea robusta, участвующих в формировании скорлупы яиц. Установлено, что процесс образования скорлупы яиц связан с морфофункциональными особенностями желточников и железы Мелиса. Функционально желточные гранулы готовы и содержат скорлуповый материал в зрелом виде (белки предшественники — недубленые белки). Желточные гранулы в оотипе или проксимальном отделе матки высвобождают белки для дубления под действием агентов. Тельце Мелиса трематоды Parastrigea robusta — многофункциональный орган, обеспечивающий активацию процесса высвобождения скорлупового материала из желточных клеток; формирование резистентной яйцевой оболочки в результате наслаивания на нее скорлупового материала; облегчение процесса перемещения яиц по петлям матки за счет «мукозных» веществ, выделяющихся клетками второго типа. Таким образом, желточные фолликулы и тельце Мелиса трематоды Parastrigea robusta представляют единый функциональный блок, который обеспечивает образование резистентной скорлупы яиц. В данном процессе одну из ключевых ролей играет железа Мелиса, желточники поставляют скорлуповый материал. Полученные данные по микроморфологии, ультраструктуре желточников и тельца Мелиса трематоды Parastrigea robusta значительно пополнят знания по особенностям процесса образования резистентной скорлупы яиц.
Введение
Эволюционным механизмом, обеспечивающим сохранение вида при развитии со сменой хозяев, является закон «большого числа половых продуктов» — яиц [1]. Большая половая продуктивность гельминтов увеличивает шансы завершить жизненный цикл до маритной стадии, тем самым обеспечивая появление следующего поколения. И как следствие, паразитические организмы, в частности, представители класса Trematoda, имеют функционально развитую гермафродитную половую систему.
Процесс формирования и стабилизации скорлуповой оболочки, несмотря на многочисленные исследования, до конца не выяснен. Ученые приходят к разным умозаключениям по функционированию желточников и тельца Мелиса как главных структурных компонентов, участвующих в формировании скорлупы яиц [2].
Для исследования выбрана трематода Parastrigea robusta, относящаяся к трематодам с дифференцированным телом. Трематоды с дифференцированным телом считаются эволюционно продвинутой группой [3], поэтому изучение строения железы Мелиса и желточников у данного вида представляет собой научный интерес. В результате проведенного исследования определены и детализированы функциональные роли желточников и железы Мелиса трематоды Parastrigea robusta.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования является трематода Parastrigea robusta (Szidat, 1928), относящаяся к подотряду Strigeata (La Rue, 1926), семейству Strigeidae (Railliet, 1919) из пищеварительной системы (кишечника) Красноголовой чернети (Aythya ferina).
Фиксирующие смеси и режим фиксации были выбраны в зависимости от целей исследования. Для гистологического исследования в качестве фиксирующего материала использована жидкость Буэна. Работа с материалом исследования началась с помещения трематод в биопсийные кассеты, после чего объект исследования прошел стадию отмывки от фиксирующей жидкости в 70 % спирте в течение 1-го дня.
Проводка материала осуществлялась с помощью гистопроцессора Medite TPC-15 (Medite, Германия), где исследуемый материал прошел стадии обезвоживания и парафинирования тканей по программе Standart 1.
Обезвоженный и пропитанный парафином материал был залит в парафиновые блоки. Тонкие срезы толщиной 5-7 микрон получали с помощью ротационного микротома. Окрас полученных срезов осуществлялся гематоксилин-эозином по методу Эрлиха [4].
Полученные гистологические микропрепараты рассмотрены на световом микроскопе Keyence Bz-9000 (Keyence, Япония) с дальнейшим фотографированием срезов на разных увеличениях.
Для электронно-микроскопического исследования собранный гельминтологический материал был зафиксирован в забуференном 0,1М какодилатным буфером (pH 7,4) 3 % растворе глютарового альдегида, после чего постфиксирован в 1 % растворе четырехокиси осмия (на 0,1М какодилатном буфере). Материал дегидратировали уранилацетатом в 70º спирте. В качестве заливочной среды использовали смолы аралдит и эпон 812. Ультратонкие срезы толщиной 60-100 нм готовили стеклянным ножом на ультрамикротоме «Ultrotome III» (LKB, Швеция). Срезы контрастировали цитратом свинца по E. Reynolds [5]. Полученные препараты просматривали и фотографировали на электронном микроскопе «JEM-100 CXII» («JEOL», Япония).
Результаты исследования и их обсуждение
Желточники Parastrigea robusta
Микроморфология. Желточные фолликулы Parastrigea robusta расположены в переднем и заднем отделах трематоды. Диаметр желточного фолликула составляет 56,6-93,3×66,6-83,3 мкм (рис. 1).
В желточном фолликуле содержатся желточные клетки на разных стадиях развития (рис. 1). Незрелые желточные клетки характеризуются несильной структурной клеточной дифференциацией, содержат крупное ядро, занимающее основную часть клетки и окрашиваемое гематоксилин-эозином в темно-фиолетовый цвет. Цитоплазма после окраски приобретает светло-розовый оттенок. По мере накопления скорлупового материала в желточных клетках уменьшается базофилия цитоплазмы.
При созревании желточных клеток размер ядра не меняется, рост клетки происходит в результате увеличения объема цитоплазмы с расположенными в ней желточными гранулами. У зрелых желточных клеток все пространство, за исключением ядра, занимает скорлуповый материал. Диаметр зрелых клеток составляет 18,6-23,3 мкм, из них 4,5-4,7 мкм занимает ядро. При окрашивании красителем гематоксилин-эозином по Эрлиху скорлуповые гранулы не прокрашиваются и на фотографиях принимают светло-желтый оттенок (рис. 1).
Ультраструктура. Желточные клетки, составляющие фолликулы, обособлены за счет тонких отростков близ расположенной паренхиматозной ткани. В результате созревания клетки претерпевают структурные и морфологические изменения.
Наши исследования показали, что желточные клетки в процессе созревания проходят 4 стадии развития (рис. 2).
Клетки 1-й стадии представлены наименьшими размерами по сравнению с клетками последующих стадий дифференциации. Большую часть объема клетки занимает ядерный аппарат. На этой стадии хроматин находится в конденсированном состоянии, т.е. представлен гетерохроматином, локализующимся, главным образом, по периферии ядра. В цитоплазме содержится большое количество свободных рибосом и полисом, встречаются небольшие участки гранулярной эндоплазматической сети, некоторое количество митохондрий. На данной стадии созревания желточных клеток не происходит синтеза скорлупового материала, т.е. клетка находится в неактивном состоянии.
Вторая стадия дифференциации характеризуется заметными перестройками в клетке: количество эухроматина в ядрах увеличивается, у большей части желточных клеток фолликула участки с эу- и гетерохроматином находятся, практически, в равном соотношении, это говорит об активации синтетических процессов. В клетках этой стадии уже заметны единичные скорлуповые гранулы.
Клетки 3-й стадии увеличиваются в размере за счет синтеза скорлупового материала. Ядро неправильной формы расположено в центральной части клетки. Происходит структурное изменение ядерного материала в сторону увеличения содержания активной формы хроматина — эухроматина. От ядра отходит гранулярная эндоплазматическая сеть, усеянная рибосомами.
Цитоплазма имеет выраженную зернистость, содержит обширные сети гранулярного эндоплазматического ретикулума с многочисленными рибосомами. Митохондрии локализуются, главным образом, возле синтезирующихся скорлуповых гранул. Разрастающиеся скорлуповые глобулы смещаются к периферии клетки. Мелкие желточные гранулы, сливаясь, образуют более крупные гранулы. Цитоплазма имеет зернистую структуру, содержит большое количество свободных рибосом и зерна гликогена.
Клетка на 4-й стадии дифференциации завершает процесс синтеза скорлуповых глобул. Желточные клетки данной стадии достигают максимальных размеров. Ядро имеет округлую форму, содержит хорошо структурированное ядрышко, хроматин находится в неактивном состоянии и представ-
лен большим количеством гетерохроматина. Желточные глобулы содержат большое количество скорлуповых гранул. Желточные глобулы могут занимать 1∕5 объема клетки.
После завершения процесса созревания клеток в желточном фолликуле зрелые клетки по желточным протокам передвигаются в область желточного резервуара, откуда поступают в оотип, где происходит образование резистентной оболочки яиц. Желточные клетки тесно контактируют с яйцевой оболочкой. На периферии яйца видны желточные глобулы, содержащие скорлуповый материал (рис. 3).
Тельце Мелиса Parastrigea robusta
Микроморфология. Тельце Мелиса расположено на заднем сегменте тела трематоды. Железа локализована между семенниками. Количество клеток тельца Мелиса невелико, они окружают оотип со всех сторон. Размер железы варьирует в пределах 85,7–214,3 мкм (рис. 4).
Железу Мелиса составляют клетки двух типов. Клетки первого типа аккумулируются вблизи оотипа, непосредственно окружая его. Клетки данного типа каплевидной или вытянутой формы, размер которых равен 5,7–8,6 мкм. Ядро имеет крупные размеры (2,3–4,3 мкм), несколько смещено от центра клетки. Железистые клетки этого типа контактируют с оболочкой формирующегося яйца и с расположенными близ оотипа в проксимальном отделе матки желточными клетками (рис. 5).
Клетки тельца Мелиса второго типа занимают более отдаленное или периферическое расположение относительно оотипа. Клетки данного типа имеют вытянутую форму и наиболее крупные размеры. Диаметр клеток равен 10–14,3 мкм, ядер — 2,3–4,3 мкм. На снимках, сделанных с помощью световой микроскопии, видно, что в цитоплазме содержатся разного рода везикулы (рис. 6).
Ультраструктура. На электрошшограммах видшо, что клетки тельца Мелиса отделешы друг от друга, каждая клетка покрыта собствешшой оболочкой. В шезрелых клетках тельца Мелиса ядро имеет крупшые размеры и локализовашо в цештральшой части клетки. Нуклеолемма двуслойшая, в ядре вид- шы большие участки электрошшо-плотшого гетерохроматиша (рис. 7). При созревашии железистых клеток гетерохроматиш замещается актившым электрошшо-светлым эухроматишом. Ядро в зрелых клетках зашимает большую часть, что примершо составляет ½ часть клетки (рис. 7).
Матрикс цитоплазмы содержит большое количество кашалов грашуляршой эшдоплазматической сети, мшогочислешшые скоплешия рибосом, формирующие полисомы. Рибосомы главшым образом скошцештрировашы ша мембрашах эшдоплазматического ретикулума. В гиалоплазме клетки тельца Мелиса обшаружешы митохошдрии. Аппарат Гольджи ше выявлеш.
Дашшые железистые клетки расположешы в области оотипа и плотшо примыкают к формирующемуся яйцу, мы их отшосим к клеткам железы Мелиса первого типа, что подтверждается отсутствием в ших вакуолей и везикул.
P. robusta паразитирует в пищеварительшом тракте, месте, где гельмишты испытывают постояш- шое химическое и мехашическое воздействие со сторошы оргаша-хозяиша; для этих гельмиштов харак- тереш сложшый жизшешшый цикл. Эти обстоятельства, которые определешы биологией и экологией гельмиштов, эволюциошшо привели к тому, что им шеобходима большая половая продуктившость, поскольку ше все яйца после попадашия во вшешшюю среду проходят все стадии развития и шаходят промежуточшого и дефишитившого хозяев. Маритшой стадии достигают едишицы. Следовательшо, чтобы обеспечить потомство и выживашие вида шеобходимо большое число яиц.
Колоссальшая половая продуктившость обеспечивается и шадежшой защитой эмбриоша в яйце, т. е. формировашием резистештшой к вшешшим условиям скорлупы.
Процесс сиштеза скорлуповой оболочки яйца у исследовашшой трематоды проходит в оотипе, куда открываются желточшые протоки, поставляющие зрелые желточшые клетки. Как подтверждают классические источшики, в оотип поступают сперматозоиды из семяприемшика и яйцеклетка из яич- шика [6].
Обсуждение и анализ результатов исследования
Зрелые желточные клетки у P. robusta аккумулируются в желточном резервуаре. Скорлуповые глобулы созревших желточных фолликулов, перемещаясь из желточного резервуара, попадают в оотип, откуда поступают в формирующееся яйцо и участвуют в процессе дубления, образуя скорлупу. Это подтверждается работами других авторов [7-9].
Наши исследования показали, что скорлуповые глобулы, содержащие скорлуповые гранулы, локализуются на периферии, примыкая к первичной мембране яйца. Цитоплазма оплодотворенного яйца у P. robusta представлена зернистой структурой умеренной электронной плотности. Окруженные тонкой оболочкой структуры в цитоплазме мы объясняем как структуры, содержащие энзимы. Они локализуются по всему сечению яйца, в том числе вблизи желточных глобул. Мы считаем, что именно под действием описанных выше энзимов происходит ускорение процесса разрушения желточных гранул с высвобождением скорлупового материала. Скорлуповые вещества, выделяющиеся при разрушении гранул, принимают участие в построении скорлупы яиц трематод.
Неопровержимо и участие тельца Мелиса в процессе образования оболочки яиц. Наши исследования показывают, что железистые клетки тельца Мелиса 1-го типа трематоды P. robusta непосредственно локализуются в области оотипа близ зрелых желточных клеток, поступивших из желточного резервуара, и формирующегося яйца. Секретируемые вещества железистыми клетками этого типа участвуют в образовании скорлупы яиц.
Клетки тельца Мелиса тесно контактируют со зрелыми желточными клетками, в межклеточном пространстве видны вещества, выделенные из железистых клеток. Мы считаем, что эти вещества являются стимуляторами для выделения скорлупового материала из желточных клеток.
Желточные глобулы встречаются по периферии формирующегося яйца. Скорлуповые гранулы, составляющие желточные глобулы, имеют более мелкие размеры, сравнивая их с таковыми в зрелых желточных клетках. По нашему мнению, желточные глобулы разрушаются с выделением скор- лупового материала, который идет на построение резистентной оболочки яиц.
Железистые клетки тельца Мелиса 2-го типа, локализованные дистально от оотипа, включают вакуоли и везикулы, имеющие разную электронную плотность. Smyth J. and Clegg K. в своих исследованиях обнаружили в составе секрета этих клеток мукополисахариды, что является доказательством слизеподобной консистенции у этих веществ [10]. Данные клетки могут улучшать процесс перемещения сформированных яиц по петлям матки.
По нашим предположениям, секрет железы Мелиса также может оказывать влияние на скорость передвижения сперматозоидов к яйцеклетке, а значит, и на активность процесса оплодотворения.
Заключение
Исследования женской репродуктивной системы трематоды P. robusta показывают непосредственное участие желточников и железы Мелиса в процессе образования оболочки формирующихся в оотипе яиц. Желточные клетки формируются в желточных фолликулах, расположенных по бокам тела гельминта. Скорлуповый материал зрелых желточных клеток под действием веществ-стимуляторов железистых клеток тельца Мелиса первого типа выделяется и участвует в создании резистентной скорлуповой оболочки.
Тельце Мелиса выполняет несколько функций, основными из которых являются:
- активация процесса высвобождения скорлупового материала из желточных клеток;
- формирование резистентной яйцевой оболочки в результате наслаивания на нее скорлупового материала;
- облегчение процесса перемещения яиц по петлям матки за счет «мукозных» веществ, выделяющихся клетками второго типа.
Список литературы
- Скрябин К.И. Трематоды животных и человека / К.И. Скрябин. — М.: Изд-во АН СССР, 1947. — Т. 1. — 516 с.
- Уалиева Р.М. Микроморфология, ультраструктура и функции желточников и тельца Мелиса трематод с недифференцированным и дифференцированным телом: автореф. дис. … д-ра философии (PhD): спец. 6D060700 — «Биология» / Р.М. Уалиева. — Павлодар, 2017. — 22 с.
- Ошмарин П.Г. Эколого-морфологические типы трематод / П.Г. Ошмарин, М.Н. Егорова. — Ярославль: Изд-во Яросл. ун-та, 1978. — С. 52–71.
- Кисели Д. Практическая микротехника и гистохимия / Д. Кисели. — Будапешт: Изд-во АН Венгрии, 1962. — 399 с.
- Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy / E.S. Reynolds // J. Cell Biology. — 1963. — No. 17. — P. 208–212.
- Гинецинская Т.А. Частная паразитология / Т.А. Гинецинская, А.А. Добровольский; под ред. Ю.И. Полянского. — М.: Высш. шк., 1978. — Т. 1. — 303 с.
- Шаймарданов Ж.К. Функциональная морфология желточных клеток трематод / Ж.К. Шаймарданов. — Павлодар: ПГУ им. С. Торайгырова, 2002. — 222 с.
- Пономарев Д.В. Сравнительная структурная и функциональная организация репродуктивных органов трематод из различных таксономических групп: автореф. дис. … биол. наук: спец. 03.00.19 — «Паразитология» / Д.В. Пономарев. — Алматы, 2006. — 29 с.
- Гребенщиков В.М. Функциональная морфология желточников трематод / В.М. Гребенщиков, Д.А. Буданцов // Рос. паразитологический журн. — 2011. — № 2. — С. 6–9.
- Kouri P. Nota Previa sobre la genesis del huevo de Fasciola hepatica / P. Kouri, J. Basnuevo et. al. // Rev. Parasitol. Clin. lab. — 1936. — Vol. 2. — Р. 173.