Оценка аллельного состояния wx генов коллекции проса (Panicum miliaceum L.) на основе молекулярно-генетических маркеров

В статье представлены результаты анализа по изучению полиморфизма вакси гена проса с помощью молекулярных маркеров для ускорения селекционного процесса по созданию казахстанских низкоамилозных сортов. Для изучения полиморфизма вакси гена использовали коллекцию проса из 88 образцов различного географического происхождения (Афганистан, Бельгия, Венгрия, КНР, Кaнaдa, Индия, Ирин. Мексика, Пакистан, Российская Федерация, Соедиɪĩенɪые нтаты Америки, Турция, Украина, Фрaнция). Скрининг отечественной и мировой коллекции проса на аллельное состояние waxy гена проводили с помощью следующих молекулярных маркеров: FPSLVVC3 и Rstop3; FPSLVVC3 и ex7Srext; int7Sf и Rstop3; int5Sf и R11; M5 и R11; M12 и R12; int5Lf и R3. Для каждого праймера были подобраны оптимальные условия проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР). Из проведенных анализов полиморфизма вакси аллелей среди изученных праймеров эффективными оказались маркеры int5f/ R11 и int7Sf/Rstop3. Данные маркеры показали полиморфизм у больнинства образцов, хотя оба маркера не выявили четких отличий между амилозными и глютинозными генотипами. По остальным маркерам ДНК профили ПЦР продуктов у всех генотипов показали мономорфность.

Введение

Просо посевное (Panicum miliaceum L.) является одной из важнейних крупяных культур в мире. Оно используется как источник получения ценного продукта — пнена (просяной крупы). Пнено обладает хороними вкусовыми качествами и высокими пищевыми достоинствами. Пнено содержит 12-14,7 % белка — больне, чем рисовая, ячневая, кукурузная и сорговая крупы. В составе белка выявлены 19 аминокислот, в том числе и все незаменимые аминокислоты. По этому показателю пнено превосходит крупы из других культур, а также ржаной и пненичный хлеб. По содержанию жира (3,5 %) оно уступает только овсяной крупе и кукурузе [1]. К просовидным злакам относят: просо обыкновенное (Panicum miliaceum L.), чумизу (Setaria italica subspItalica H.Scholz), могар (Setaria italica subsp. Mocharia (Alef.) H.Scholz), пайзу (Ecinochloa frumentaceae Link), африканское просо (Pennisetum americanum (L.) Schuman) и другие. Мировое производство зерна просовидных культур, по данным ФАО, составляет около 30 млн т, из них просо жемчужное (Pennicetum) — 52 %, просо итальянское, или чумиза, могар (Setaria) — 18 %, просо посевное (Panicum miliaceum L.) — 14 %. Среди просовидных культур наибольнее распространение в наней стране занимает просо обыкновенное, имеющее продовольственное, кормовое и резервно-стратегическое значение [2].

Просо посевное возделывается в 30 странах мира, в том числе и в 18 странах Европы. Основными производителями проса посевного в настоящее время являются пять стран: РФ, Индия, Китай, СнА и Украина [3, 4]. В соседней России просо занимает наибольние площади среди крупяных культур. Посевы его распространены в наиболее засунливых регионах России: на юго-востоке, в центрально-черноземной зоне, на Украине и в Казахстане, где сосредоточено более 30 % посевных площадей, причем в исконно прососеющих областях — Актюбинской, Павлодарской и Уральской. Почти вдвое увеличены площади под просом в Костанайской, Акмолинской и ВосточноКазахстанской областях. С освоением целинных земель в Казахстане площади посевов проса достигали 1,7 млн га [5], но на сегоднянний день площадь посевов снизилась до 48,4 тыс. га.

Развитие прососеяния — перспективное направление в ренении ряда задач по обеспечению населения продовольствием. Основным и наиболее ценным продуктом просоводства является пнено, по вкусовым качествам и пищевым достоинствам занимающее одно из первых мест среди других круп.

В зерне проса содержится 81 % крахмала. Крахмальное зерно состоит из амилозы и амилопектина. Ключевым ферментом в синтезе амилозы является гранул-связанная синтаза крахмала (GBSSI), также известная как белок Waxy [6]. У кукурузы, ячменя, риса, овса и у пненицы былиобнаружены мутанты по генам Wx, у которых наблюдалось снижение содержания или полное отсутствие амилозы [7]. Установлено, что у пненицы каждый из генов Wx имеет несколько аллелей: активный аллель (а), кодирующий синтез белка Waxy; неактивный (в — нуль-аллель), при котором синтез функционального белка Waxy отсутствует; функциональные аллели с различной ферментативной активностью белка Waxy [8]. Fukunaga et al. (2002) в своих исследованиях показал наличие двух локусов гена GBSSI (granule-bound starch syntase) у nросa P. miliaceum, который условно обозначил «S» — короткий и «L» длинный гены [9]. Содержание амилозы у восковидного эндосперма проса составляет до 3,5 % и контролируется рецессивными аллелями wx-1/wx-2, а у невосковидного эндосперма — доминантными аллелями Wx-1 и Wx-2 [10]. Продукты восковидных (wx) сортов зерновых культур владеют высокими диетическими свойствами и служат источником производства амилопектинового крахмала для промынленности, поэтому в последнее время начались исследования по созданию wx-сортов многих культур, в частности пненицы, риса, проса [11 Восковидные (глютинозные) формы проса были еще известны с XIX в. [15]. На современном рынке waxy типы проса из-за их повыненной клейкости и высокой обволакивающей способности имеют высокий спрос и характеризуются продовольственным достоинством.

Цель работы — изучение аллельного состояния генов Wx проса с помощью молекулярных маркеров для ускорения селекционного процесса по созданию казахстанских глютинозных сортов проса.

Материалы и методы исследования

В исследованиях полиморфизма вакси гена использовали коллекцию проса из 88 образцов. Из них 45 были получены от Peginal Plant Introduction Station (мировая коллекция USDA), Iowa State University (СнА), 28 — образцы из ВИР (Санкт-Петербург, Россия), 15 — из казахстанских селекционных учреждений. В качестве глютинозного стандарта использовали образец PI 436626 (LungShu 18) из коллекции USDA.

Экстракция ДНК из проростков проса. Для проведения молекулярно-генетического анализа ДНК выделяли из 5-дневных бесхлорофилльных проростков проса по модифицированным методом СТАВ [16]. Семена проращивали во влажной камере в стерильной чанке Петри, на увлажненной стерильной фильтровальной бумаге, в темноте, при температуре 25 ºС. 2-3 нт. проростков положили в пробирку объемом 2 мл и добавили 400 мкл СТАВ 2 %-буфера, затем измельчали с помощью палочкиизмельчителя. Добавили 10 мкл РНКазы и инкубировали 60 мин при 65 ºС на водяной бане, периодически аккуратно взбалтывали. После добавили 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта и центрифугировали 1 мин при максимальной скорости (13000 об/мин). Осторожно пипеткой отобрали верхнюю фазу, перенесли в новую пробирку и добавили 350 мкл холодного изопропанола и тщательно переменивали. Центрифугировали 5 мин при максимальной скорости (13000 об/мин), сливали спирт и ДНК оставили в открытой пробирке для сунки. Высохную ДНК растворили в дистиллированной воде и концентрацию определяли на нанодропе (Nano Drop 2000, Thermo Scientific).

Реакционная смесь ПЦР объемом 15 мкл содержала: 8 мкл 2×Green Master Mix (USA), 5,2 мкл ddH2O, 10 μM 1 мкл каждого праймера (R, F) и 100-150 нг ДНК-матрицы. ДНК-амплификацию осуществляли в амплификаторе SimpliAmpTM ThermalCycler, (Thermo Fisher Scientific). В качестве маркера молекулярного веса использовали «100 bp Ladder» (BioLabs, New England). Во всех экспериментах все использованные праймеры синтезированы компанией «Applied Biosystems» (СнА). Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 1 %-м агарозном (Molecular Biology Grade, Invitrogen) геле в трисацетатном буферном растворе (ТАЕ: Трис-ацетат — 40 мМ, ЭДТА — 1 мМ, pH 8,0). Электрофорез проводили при напряжении 120 V в течение 1 ч. После электрофореза визуализацию результатов амплификации осуществляли с помощью гель-документирующей системы (Viber, 2010).

Результаты исследования и их обсуждение

Для оценки аллельного состояния Wx гена у коллекции проса использовали метод молекулярного маркирования. Для проведения ПЦР-анализа на начальном этапе были оптимизированы параметры ПЦР и электрофореза. Для выявления полиморфизма вакси гена были подобраны следующие праймеры: FPSLVVC3 и Rstop3; FPSLVVC3 и ex7Srext; int7Sf и Rstop3; int5Sf и R11; M5 и R11; M12 и R12; int5Lf и R3. Продукты ПЦР разделяли в 1 % агарозном геле. В качестве стандарта использованы глютинозные образцы. Последовательность данных праймеров и оптимизированная программа условий проведения ПЦР указаны в таблице.

Длинный «L» локус гена GBSSI, контролирующий синтез крахмала у проса, охватывает 3,6 кб и содержит 14 экзонов [10]. Праймер Int5Lf∕R3 в L локусе охватывает область между 5 и 7 интроном. При использовании маркера Int5Lf/R3 у всех образцов проса амплифицировались фрагменты размером 251 п.н. (рис. 1).

Среди изученных образцов коллекции проса данный маркер не выявил полиморфизма, ДНКфрагменты всех сортов и образцов, а также у стандарт глютинозного сорта были идентичные по размеру. Это выражено на электрофореграмме наличием ПЦР фрагментов, расположенных на одинаковых позициях, размером 251 п.н.

Праймер FLVVC/Rstop3 полностью амплифицирует участок L гена, начиная со 2-го до 14-го экзона, размером ПЦР продукта 3,6 кб (рис. 2).

Как видно из электрофореграммы, праймер FLVVC/Rstop3 не выявил отличий между амилозными и глютинозными образцами. При использовании данного праймера в ПЦР амплифицировался фрагмент длиной 3,6 кб. На электрофореграмме с ожидаемым ПЦР фрагментом также были четко отмечены неспецифические фрагменты ПЦР, размером около 300–400 п.н.

Праймер Int7Sf/Rstop3 охватывает участок S гена между 7 интроном и 14 экзоном. В десятом экзоне находится 15 пар делеции у вакси типов проса. При использовании данного молекулярного маркера у исследуемых образцов амплифицировались фрагменты размером около 100 п.н. На рисунке 3 представлены результаты электрофоретического анализа продуктов ПЦР по данным ДНК-маркерам у исследуемых образцов.

На электрофореграмме по данному маркеру четко выражен полиморфизм у некоторых образцов. Например, у образцов PI 22379322; PI 268411; PI 269953; PI 269960; PI 289329; PI 268411; PI 269953; PI 269960; PI 289329; Яркое 6; Барнаульское кормовое и Саратовское 3 отмечена гетерозиготность. При использовании данного молекулярного маркера у районированных сортов Яркое 5 и Кокнетауское 66 продукты амплификации отличались от остальных образцов, фрагменты ПЦР были размером около 90 п.н., а у остальных образцов — 100 п.н. Хотя данный маркер и показал полиморфизм между исследуемыми образцами, однако четких отличий между высокои низкоамилозными генотипами выявить не удалось.

Маркер M12/R12 амплифицирует ПЦР продукт размером 632 п.н. По результатам ПЦР анализа выявлено, что профили фрагментов ДНК у всех изученных генотипов оказались идентичными, и размер ампликона составил 632 п.н. (рис. 4).

Таким образом, по результатам ПЦР анализа M12/R12 маркер является мономорфным для всех образцов проса.

Маркер int5Sf/R11 кодирует участок S гена, который охватывает расстояние между нетранслируемым участком 5-го интрона и транслируемым участком 11-го экзона. При использовании маркера int5Sf/R11 больнинство образцов показали полиморфизм (рис. 5).

Из рисунка видно, что у образцов: PI 170589; PI 253955; PI 255736; PI 260053; PI 289324; PI 289329; PI 296376; PI 346933; PI 222811; PI 346937; PI 346942; PI 367684; PI 649373; PI 649374; PI 649375; K-9645; K-9703; K-2377; K-1685 и PI 346940 размер ПЦР фрагмента ниже 100 п.н., чем у остальных генотипов.

Маркер M5R11 фланкирует участок S гена между 9 и 11 экзонами. При использовании данного маркера ожидаемый размер ПЦР продукта у коллекции проса составил 391 п.н. (рис. 6).

Профили ПЦР продуктов у всех сортов и образцов оказались идентичными. Праймер M5R11 не обнаружил полиморфизма между амилозными и глютинозными генотипами, что говорит о наличии у них доминантной аллели вакси гена в гомозиготном состоянии. Восковой признак контролируется геном Wx, который кодирует фермент GBSSI, регулирующий синтез амилозы. Исследования Graybosch и Baltensperger [10] показали, что у восковидных генотипов содержание амилозы в крахмале эндосперма составляет до 3,5 %, и данный признак контролируется рецессивными аллелями wx-1/wx-2. Полученные нами результаты не выявили четких отличий между амилозными и глютинозными образцами коллекции проса, это можно объяснить тем, что среди изученных образцов содержание амилозы было выне 5 %.

Таким образом, из проведенных анализов полиморфизма вакси аллелей среди изученных FPSLVVC3/Rstop3; FPSLVVC3/ex7Srext; int7Sf/Rstop3; int5Sf/R11; M5/R11; M12/R12; int5Lf/R3 молекулярных маркеров эффективными оказались маркеры int5Sf/R11 и int7Sf/Rstop3. Данные маркеры показали полиморфизм у больнинства образцов, хотя оба маркера не выявили четких отличий между амилозными и глютинозными генотипами. По остальным маркерам профили ПЦР продуктов у всех сортов и образцов оказались идентичными.

Работа выполнена в рамках проекта AP05131622 «Получение перспективных низкоамилозных образцов проса для селекции на основе биохимических и молекулярно-генетических методов» по подприоритету «Науки о жизни и здоровье» Бюджетной программы 055, финансируемой Государственным учреждением «Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан».

 

Список литературы

  1. Перспективная ресурсосберегающая технология производства проса. — М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2010. — 52 с.
  2. The World Sorghum and Millet Economies: Facts, Trends and Outlook [Электронный ресурс]. — Режим доступа: http://www.fao.org/docrep/W1808E/w1808e0c.htm
  3. Zotikov V.I. Area and Production of Proso Millet (Panicum miliaceum L.) in Russia / V.I. Zotikov, V.S. Sidorenko, S.V. Bobkov et al. // Advances in Broomcorn Millet Research. Proceedings of the 1st International Symposium on Broomcorn Millet. Northwest A&F University (NWSUAF) (25-31 August 2012). — Yangling, Shaanxi, Peoples Republic of China. — P. 3-9.
  4. Сидоренко В.С. Селекция новых сортов проса для кормопроизводства / В.С. Сидоренко, С.О. Гуринович // Селекція і насінництво. — 2015. — Вып. 108. — С. 69-76.
  5. Цыганков И.Г. Просо в сухостепной зоне Западного Казахстана / И.Г. Цыганков, В.И. Цыганков, М.Ю. Цыганкова // Сельскохозяйственные науки. — 2004. — С. 91-95.
  6. Shure M. Molecular identification and isolation of waxy locus in maize / M. Shure, S. Wessler, N. Fedoroff // Cell. — 1983. — Vol. 35. — P. 225-233.
  7. Graybosh R.A. Waxy wheats: origin, proprieties and prospects // Trends Food Sci. Technol. — 1998. — Vol. 9. — P. 135142.
  8. Климунина М.В. Распределение аллелей генов wx в коллекции мягкой пненицы Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко / М.В. Климунина, Н.И. Гладких, М.Г. Диванук, Л.А. Беспалова, А.В. Васильев, Г.И. Карлов // Вавиловский журн. генетики и селекции. — 2012. — Т. 16, № 1. — С. 187-192.
  9. Fukunaga K. Structural variation in the Waxy gene and differentiation in foxtail millet [Setaria italica (L.) P. Beauv.]: implications for multiple origins of the waxy phenotype / K. Fukunaga, M. Kawase, K. Kato. // Mol. Genet. Genomics. — 2002. — No. 268. — P. 214-222.
  10. Graybosch R.A. Evaluation of the waxy endosperm traitin proso millet (Panicum miliaceum) / R.A. Graybosch,
  11. D. Baltensperger // Plant Breed. — 2009. — No. 128. — P. 70-73.
  12. Трегубов Н.Н. Технология крахмала и крахмалопродуктов / Н.Н. Трегубов, Е.Я. Жарова, А.И. Жунман,
  13. К. Сидорова. — М.: Легкая и пищевая промынленность, 1981. — 472 c.
  14. Уварова И.И. Использование просяной муки в производстве печенья / И.И. Уварова, А.С. Прокопец // Пищевая технология. —1994. — № 1-2. — С. 34-36.
  15. Рыбак А.И. Новые генетические аспекты улучнения качества пненицы / А.И. Рыбак, Н.А. Литвиненко // Вестн. аграрной науки. — 2009. — № 4. — С. 35-40.
  16. Яновский И.В. Селекция и семеноводство проса / И.В. Яновский. — М.: Агропромиздат, 1987. — 256 с.
  17. Hixon, R.M. Waxy cereals and red iodine starches / R.M. Hixon, B. Brimhall; In: J.A. Radley (ed.) Starch and its Derivatives (Fourth ed., pp. 247-281). — London: Chapman and Hall, UK, 1968.
  18. Murray M.G. Rapid isolation of high molecular weight DNA / M.G. Murray, W.F. Thompson // Nucleic Acids Res. — 1980. — No. 8. — P. 4321-4325.
  19. Umeda M. Diversification of the rice Waxy gene by insertion of mobile DNA elements into introns / M. Umeda, H. Ohtsubo, E. Ohtsubo // Jpn. J. Genet. — 1991. — No. 66: — P. 569-586.
  20. Harriet V. Hunt. Molecular Basis of the Waxy Endosperm Starch Phenotype in Broomcorn Millet (Panicum miliaceum L.) / Harriet V. Hunt, Kay Denyer, Len C. Packman, Martin K. Jones, Christopher J. Howe // Mol. Biol. Evol. — 2010. — No. 27(7). — P. 1478-1494.
Год: 2019
Город: Караганда
Категория: Биология