Микробиоценоз респираторного тракта при хронических заболеваниях дыхательной системы

АННОТАЦИЯ

Проведен анализ результатов изучения микробного состава различных биосубстратов у разных возрастных групп пациентов с неспецифическими заболеваниями верхних дыхательных путей. Изучена микрофлора задней стенки глотки и с хроническим тонзиллитом, хроническим фарингитом и т.д. Установлены этиологически значимые пороги высеваемости представителей условно патогенных микроорганизмов при исследовании слизистой задней стенки глотки, мокроты в группе пациентов с хроническими соматическими заболеваниями. Спектр представителей микрофлоры слизистой задней стенки глотки, мокроты при патологиях дыхательной системы был разнообразен как качественно, так и количественно, со значительной вариабельностью лидирующего этиопатогена по годам. Так, в мокроте за 20-летний период пневмококк уступил лидирующую позицию золотистому стафилококку, доля которого выросла в 4,8 раза и составила 35,8% случаев. Следовательно, выявлен рост этиологической значимости условно-патогенных микроорганизмов.

Отсутствие полных данных об этиологической структуре, биологических свойствах возбудителей и смене микробного пейзажа при заболеваниях дыхательной системы (ЗДС) приводит к низкой эффективности консервативного лечения. По мнению авторов (1999) [2], при хронических формах инфекций, увеличении кратности воспалительного процесса в бронхиальном дереве может расширяться спектр бактериальных агентов. Кроме того, в результате воздействия комплекса факторов происходят существенные изменения в эволюционно сложившихся микробиоценозах организма, что, собственно, приводит к увеличению числа заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), которые относятся преимущественно к индигенной флоре [3]. В российской литературе при оценке роли условно-патогенных микроорганизмов в развитии гнойно-воспалительных заболеваний (ГВЗ) дыхательных путей авторы в основном ссылаются на иностранные источники [4-6], и лишь по нескольким регионам имеются собственные сведения. Основными бактериальными возбудителями острых инфекций верхних дыхательных путей, по данным Л.С. Страчунского и Е.И. Каманина, являются S. pneumoniae и H. Influenzae [7].

Цель нашей работы проведение анализа результатов изучения микробного состава различных биосубстратов, забранных у разных возрастных групп пациентов с неспецифическими заболеваниями верхних дыхательных путей.

Материалы и методы. Нами была изучена микрофлора:

• задней стенки глотки от 510 пациентов с хроническим тонзиллитом, хроническим фарингитом и т.д. Количество выделенных и идентифицированных культур, составляло 656 штаммов;
• мокроты от 1238 пациентов с заболеваниями дыхательной системы. Выделенных и идентифицированных культур было 1262 штамма.

Искусственное культивирование аэробов и факультативных анаэробов проводилось общеизвестными способами в соответствии с приказом М3 СССР № 535 от 1985 г. "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений" с дальнейшей идентификацией до вида [7]. Микроскопический метод, основанный на изучении морфологических признаков возбудителя, был направлен на обнаружение микроорганизмов в нативных или окрашенных препаратах по Граму. Для осуществления посева мазков со слизистой задней стенки глотки применялся метод секторных посевов по Голду, подробно описанный в работах [7-9]. За единицу учета обсемеиенности в нашем исследовании брали КОЕ/гр и КОЕ/мл, которая позволяла выдать четкое количественное значение обсемененности в любом биосубстрате обследуемых пациентов, например, обссмснснность: 2,7xl O², 10³, 6,9xl O⁵ и т.д. КОЕ/гр или КОЕ/мл.

В работе применены схемы-”ключи" идентификации, разработанные нами и защищенные предварительными патентами: № 17800 от 2006 г. "Способ идентификации микроаэрофилов" № 18874 от 2007 г. "Способ идентификации энтеробактерий", №19106 от 2008 г. "Способ идентификации стрептококков" и № 22776 от 2010 г. "Способ идентификации грамположитсльных кокков". Все они были разработаны на основе 9-го определителя Берджи [10]. Достоверность различия показателей оценивалась в соответствии с критерием Стьюдента. Уровень доверительной вероятности сосгавлял >0,95 (P≤0,05).

Результаты и обсуждение. За период 2001-2007 гг. бактериологическим методом нами исследованы биосубстраты, забранные из различных экологических ниш, составившие в целом 1748 образцов. Этиологическая причастность микрофлоры доказана в 87,8± 1,28 % случаев, или 488 культур. Определено достоверное превалирование встречаемости моновариантов установленных этиопатогенов на фоне резидентных представителей слизистой оболочки полости рта (СОПР), что составило 91,8÷ 1,24 % случаев.

Кроме того, установлено, что из числа изолированных 40 микст-вариантов 25 % составили бактериально-грибковые ассоциации. В дальнейшем более пристальное исследование выполнялось только на клинических изолятах, а последующий анализ проводился в нескольких аспектах.

Во-первых, проведен частотный анализ встречаемости того или иного микроорганизма в микробном составе зева обследованных лиц.

Во-вторых, выполнен сравнительный анализ частоты встречаемости этиопатогенов в 7и 20-летнем временном интервале на материале одного и того же мегаполиса.

В-третьих, определен этиологически значимый пороговый уровень оценки высеваемости этиопатогенов.

Суммируя результаты изучения микробного состава мазков из зева у пациентов, следует выделить очевидное разнообразие его видового состава, представленного аэробно-анаэробными микроорганизмами, от 448 культур, принадлежащих к 34 видам этиопатогенов. Последние были объединены нами по генетическому родству в (Staphylococcus, Enterococcus, Corynebacterium, Actinomyces), семейства (Enterobacteriaceae), группы ("оральные" стрептококки, НГОБ) и отдельные клинически значимые виды (S. pyogenes, S.agalactiae, C.albicans, B.cereus).

Первые позиции по частоте выделения заняли бактерии рода Staphylococcus 35,8 % с преимуществом золотистого стафилококка и бактерии рода Streptococcus 14,3 % с лидерством S.руOgcncs 5,6 %; обнаружение двух видов бета-гемолитических стрептококков: S.pyogenes, S.agalactiae в сумме составляло 7,1 % случаев, что чревато тяжелым клиническим течением заболевания.

Следующие позиции поделены между бактериями рода Enterococcus (7,5 %) с превалированием E.facials (4,1 %) и E.faecium (3,4%), бактериями семейства Enterobacteriaceae (7 %) с лидерством Е.соİɪ (3,2 %) и дрожжеподобными грибами рода Candida (7 %). На долю НГОБ пришлось 4.3 %, а среди неферментирующих грамотрицателыɪых бактерий в большинстве были Acinetobacter 1,5 %. Corynebacterium во всех случаях выделения (2,1 %) были представлены Qdiphtheriae, изучение которых предусмотрено нормативным документом [И]. Нами с помощью метода двойной диффузии в геле был выявлен основной признак патогенности этих микроорганизмов токсинообразование, что явилось основанием для пересмотра клинического диагноза. Биохимическое типирование позволило в 3-х случаях определить тип mitis, а в 1 случае gravis. Кроме того, зарегистрированы единичные эпизоды выделения актиномицетов в качестве этиопатогенов в 0,5 % случаев. Они, собственно, представляли интерес не только высокими показателями степени обсемененности клинического материала, но и их изоляцией в монокультуре сапрофитных микроорганизмов рода Bacillus в 3,7 % случаев с преобладанием B.cereus.

Анализируя этиологическую причастность отдельно взятых микроорганизмов за 4-летний период к возникновению воспалительных процессов в верхних дыхательных путях, следует отметить неоднозначность клинической роли каждого из основных микробов и вариабельность частоты их высеваемости по годам. Основное место по частоте встречаемости за весь обсуждаемый период занимали золотистые стафилококки, которые, несмотря на то, что в 2001 г. насчитывали лишь 15,1±2,43 % случаев, к 2003 г. достигли пика, составив 58,7±2,97 % случаев. При этом некоторый спад обнаружения наметился в 2005 г. 24,2±4,18 % случаев и к 2007 г. прослеживалось ощутимое их снижение до 5,6±2,99 % случаев.

Бактерии рода Enterococcus обнаруживались в образцах 3-х лет из 4-х, но частота выявления была достаточно высокой в 2001 г. 24,8±2,93 %, в 2007 г, 25,9±5,71 % с последующим резким снижением процента встречаемости в 2005 г. 6 % случаев.

За исследуемый период встречаемость грибов рода Candida, в частности C.albicans, представлена двумя годами (2001,2005). Частота встречаемости была практически на одном уровне и составила по годам 16,1±2,49% и 17,2±3,68% случаев соответственно. По полученным результатам изучения микробного пейзажа заслуживает внимания факт выделения C.albicans в ассоциациях, составивших одну четвертую часть всех микстов. В обсуждаемых случаях C.albicans изолирована в союзе с грамположительными кокками: S,aureus в 15,0±l,39 %, Sxpidennidis в 5,0±0,85 % случаев и со S.ρyogenes в 5,O±O,85 % случаев.

Известные, как облигатные представители кишечной флоры условно-патогенные энтеробактерии (УПЭ), присутствие которых вообще недопустимо в настоящей эконише, по частоте обнаружения на слизистой задней стенке глотки, за изучаемый период продемонстрировали стабильные показатели. Так, в 2003 г. этот показатель был равен 12,6±2,01 % и в 2005 г. П‚б±З‚İЗ % случаев. Тогда как отрадно отметить, что для 2001 г. и 2007 г. был характерен низкий уровень их этиологической причастности, а именно 7,5±1,79 % и 1,9±1,78 % случаев соответственно.

Другая группа, известная как неферментирующие грамотрицательные бактерии (НГОБ), за обсуждаемый период интересна тем, что пик частоты встречаемости приходился на 2001 г. (24,7±2,93 %) с последующим постепенным понижением до 14,7±2,14 % случаев в 2003 г. и до 3,5±1,79 % 3,7±2,46 % случаев в 2005 и 2007 гг. соответственно.

Анализ результатов исследования слизистой задней стенки глотки по выделению инвазивного бета-гемолитического стрептококка группы А демонстрировал достаточно ровные показатели, за исключением 2001 г. при полном отсутствии выделения. В 2003 г. S.pyogenes был определен в 10,5±2,09 %, в 2005 г. в 10,1 ±2,94 % и в 2007 г. обнаружено снижение до 3,7±2,46 % случаев.

Несколько иная ситуация складывалась в отношении S.agalactiae, когда установлены лишь единичные эпизоды встречаемости в течение 3-х лет из 4-х. В 2001 г. он определялся в l,l±0,7 %, в 2005 г. в 2,5±1,52 % и в 2007 г. в 7,4±3,4 % случаев.

Таким образом, сравнительный анализ микробного пейзажа каждого из изучаемых годов XXI столетия по отдельности выявил различия в структуре пейзажа по основным 7, изолированным нами этиопатогенам воспалительных процессов задней стенки глотки, таких как S.aureus, S. pyogenes S.agalactiae, С. albicans, энтерококки, семейство Enterobacteriaceae и НГОБ. Так, если 2001 г. отличало лидерство энтерококка и НГОБ, а грибы рода Candida занимали третье место, то уже в 2003 г. ориентиры поменялись и в подавляющем большинстве регистрировались золотистые стафилококки, сохранявшие свое лидерство и в 2005 г., хотя и с более низкими показателями встречаемости. Однако к 2007 г. вновь обнаруживалась доминанта энтерококков.

На сегодняшний день в отношении учета резидентных видов микроорганизмов не предлагаются критерии степени обсемененности слизистой задней стенки глотки. В этой связимы сочли возможным определить пороговые показатели степени обсемененности микроорганизмами данного эпитопа для хронических больных с соматической патологией верхних дыхательных путей. Так, в 80-е гг. посредством бактериологического метода изучался в сравнительном аспекте микробный состав 3-х видов материала от больных с хронической патологией верхних и нижних дыхательных путей. Было установлено, что уровень успешных (положительных) находок из мокроты, бронхиального смыва и мазков с задней стенки глơгки, оказался неоднозначным. Наибольший процент высеваемости в диагностически значимой концентрации микроорганизмов IO⁷ КОЕ/мл, составили носоглоточные мазки 86,2±2,6 % (в основном среди детей). Изолирование возбудителя насчитывало 76,8±3,9 %, и по результатам изучения микрофлоры бронхиальных смывов выявлено в 45,9±8,1 % случаев.

Научной новизной работы в те годы явилась установленная доминирующая роль S.pneumoniae 78,1±2,2 % с выявленной впервые региональной особенностью по серотиповой их специфичности. Анализ этиопатогенов в зависимости от изучаемого биосубстрата показал, что следующим по клинической значимости после пневмококка оказался S.aureus, выделение которого из мокроты составляло 10,l±2,7% и из носоглоточных мазков 7,4±1,9%. В то время как изоляты, выделенные из бронхиальных смывов, составляли 27,0±7,2 % случаев. Параллельно энтеробактерии регистрировались из бронхиальных смывов в 16,2±6,0 %, из мокроты в 4,2±1,8 % и носоглоточных мазков в l,7±0,9 % случаев.

Приоритеты за 20-летний период поменялись: резко снизился уровень этиологической причастности пневмококка и, наоборот, выросла значимость золотистого стафилококка с параллельным появлением в микробном пейзаже представителей рода Entcrococcus. Так, лидирующее значение пневмококка упало до 2 % случаев, а встречаемость S.aureus возросла в 4,8 раза и составила в последние годы 35,8 % случаев.

Сравнение активизации представителей семейства Enterobacteriaceae, позволило выявить их рост в 4,1 раза. Обнаружение бактерий рода Enterococcus (7,5 %) в этиологически значимой концентрации, из нехарактерной экологической ниши, на наш взгляд, результат эндогенного инфицирования организма пациента. Адаптационный потенциал респираторных клинических изолятов требует изучения их персистентного потенциала.

По полученным результатам мы сочли возможным определить пороговые показатели клинически значимых степей обсемененности микроорганизмами данного эпитопа для хронических больных с соматической патологией верхних дыхательных путей.

Как видно, для энтеробактерий обсемененность варьировала от IO⁵ КОЕ/мл (60% случаев) до 2xl O⁶ КОЕ/мл. Усредненный показатель соответствовал 2,2xlO⁶±O,98xlO⁶ КОЕ/мл, что позволило вывести количественный критерий этиологической значимости для энтеробактерий и энтерококков, составивший IO³ КОЕ/мл и более.

В отношении зарегистрированных степеней обсемененности энтерококков отмечено варьирование от IO³ КОЕ/мл (53 % случаев) до IO⁷ КОЕ/мл, что соответствовало усредненному показателю 1,0.x 10⁶±0,1 Зх 10⁶ КОЕ/мл. Соответственно выведен количественный критерий этиологической значимости для энтерококков, составивший IO³ КОЕ/мл. и более.

Колонизация слизистой золотистым стафилококком варьировала от 10⁴ КОЕ/мл (47 % случаев) до IO⁷ КОЕ/мл, что соответствовало усредненному показателю 6,5xl0⁶±l,60xlO^ft КОЕ/мл.

В наших исследованиях обссмснснность коагулазоотрицательные стафилококки (КОС) в качестве этиопатогенов варьировала от IO⁶ КОЕ/мл (58% случаев) до IO⁷ КОЕ/мл. Усредненный показатель соответствовал 2,3x 10⁶±0,61X1 O^ft КОЕ/мл. В итоге для золотистого стафилококка нами выведен критерий клинической значимости в возникновении воспалительного процесса слизистой задней стенки глотки, равный концентрации IO⁴ КОЕ/мл и более. Для КОС выведен более высокий показатель IO⁶ КОЕ/мл и выше, что обусловлено их принадлежностью к резидентной аутофлоре ротовой полости.

Стрептококки принято относить к пиогенным коккам, что во многом связано с главным для медицины видом S.pyogenes мощным индуктором септических (гнойных) процессов. В этой связи, учитывая полученный нами высокий процент (68 %) изоляции этого вида микроба в низкой концентрации IO³ КОЕ/мл.

до 10⁷ 42,0±8,59 ⅞

Примечание: *Различие достоверно с другими показателями данного микроорганизма. ’"Различие достоверно с наименьшим показателем данного микроорганизма.

При наличии яркой клиники латентного течения был установлен критерий для пиогенного стрептококка IO³ КОЕ/мл и более.

Эпизоды выделения S.agalactiae в обсемененности 6,9xl0⅛l,31xl0⁵ КОЕ/мл у обследуемых нами пациентов, когда в 38 % случаев S.agalactiae выделялся в обсемененности IO⁴ КОЕ/мл, позволили вывести критерий для данного возбудителя, соответствовавший IO⁴ КОЕ/мл и более.

По полученным результатам наблюдений оральные стрептококки выделялись исключительно в монокультуре и высокой степени обсемененности, равной 2,7xl 0⁷±0,32xl O⁷ КОЕ/мл, и признаны этиопатогенами воспалительного процесса с учетом наличия клинически установленного воспалительного очага. Частота выделяемое™ в концентрации IO⁷ КОЕ/мл, составившая 65 % случаев, и послужила основанием для выведения критерия обсемененностив случае оральных стрептококков IO⁶ КОЕ/мл и более.

Степень обсемененности у обследуемых пациентов грибами рода Candida составляла в среднем 7,8xl0⁴±l,13xl0⁴ КОЕ/мл, а в 71 % случаев концентрация была равна IO^s КОЕ/мл. В эпизодах, когда Candida высевалась в ассоциации с бактериями (20 % случаев), степень обсемененности была на порядок ниже. C учетом полученных результатов нами выведен критерий оценки степени обсемененности грибами рода Candida задней стенки глотки в монокультуре IO⁵ КОЕ/мл и выше, в миксте IO⁴ КОЕ/мл и выше.

Степень обсемененности бактерий группы неферментирующих грамотрицательных палочек (НГОБ) составляла в среднем l,2xlθ⁷±θ,69xlθ⁷ КОЕ/мл, а процент штаммов, выделенных в IO⁴, насчитывал 47% случаев. Исключением явились штаммы Raeruginosa, которые обнаруживались на задней стенке глотки в монокультуре в среднем в 5,8xl0⁵±l,52xl0⁵ КОЕ/мл. При этом в 53% случаев концентрация микробных клеток составляла IO³ КОЕ/мл. Объективным явилось и выведение двух критериев как для группы, так и для синегнойной палочки, в частности для Raeruginosa IO³ КОЕ/мл и выше, а для других НГОБ IO⁴ КОЕ/мл и выше.

Таким образом, по результатам анализа полученных данных нами были установлены этиологически значимые пороги выссвасмости представителей условно-патогенных микроорганизмов при исследовании слизистой задней стенки глотки, мокроты в группе пациентов с хроническими соматическими заболеваниями. Спектр представителей микрофлоры слизистой задней стенки глотки, мокроты при патологиях дыхательной системы был разнообразен как качественно, так и количественно, со значительной вариабельностью лидирующего этиопатогена по годам. Так, в мокроте за 20-летний период пневмококк уступил лидирующую позицию золотистому стафилококку, доля которого выросла в 4,8 раза и составила 35,8 % случаев, т.с. выявлен рост этиологической значимости условно-патогенных микроорганизмов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Приказ № 535 М3 СССР. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применимых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. M., 1985.
2. Зинкевич О.Д., Бондаренко В.M., Делян В.Ю. и др. Особенности гуморального антибактериального иммунитета у детей раннего возраста с заболеваниями органов дыхания // Микробиол. 1999. № 2. С. 65-68.
3. Бакулин Н.И., Батуро А.П., Блинкова Л.П. и др. Бактериология: Частные аналитические технологии в клинической лаборатории ⁄ под рсд. В.В. Меньшикова M.: Агат-Мсд, 2003. С. 13-14.
4. Авдеев С.H., Чучалин А.Г. Роль бактериальной инфекции и выбор антибиотиков при обострении хронического бронхита // Consiliummcdicum. 2000. № 2 (10). С. 418-425.
5. Синопальников А.И. Стандарты антибактериальной терапии госпитальной пневмонии // Военно-медицинский журнал. 2001. № 1. С. 37-44.
6. Яковлев С.В., Дворецкий Л.И., Суворова М.IJ. Бактериальные инфекции в амбулаторной практике: выбор оптимального антибактериального препарата // ConsiliumMedicum. 2002. № 4 (1). С. 8-15.
7. Ермолина Г.Б., Беляева Е.В.. Дегтева Г.К., Меньков Н.В., Борискина Е.В. Особенности микрофлоры дыхательных путей при различных респираторных заболеваниях: Мсжрсгион. науч.¯ практ. конф. // Актуальные вопросы онкологической службы, посвящен. 8-летию онкологической службы Нижиегородской области, Конгресс-центр ГК "OKA"7-8 ноября 2013.
8. Фельдман Ю.М., Маханеева Л.Г., Шапиро А.В. и др. Количественное определение бактерий в клинических материалах // Лаб. дело. 1988 № 4. С. 616-618.
9. Зубков М.Н. Сбор, транспортировка биологического материала и трактовка результатов микробиологических исследований // Клин, микробиол. Антимик. химиотерапия. 2004. Т. 6, №2. 151 с.
10. Определитель бактерий Берджи: под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П.Смита и др. ⁄ 9-е изд. M.: Мир, 1997. 24 с.
11. Минаев В.И., Миронов А.Ю., Решедько Г.К. Биоматериалы при инфекциях нижних дыхательных путей // Частные аналитические технологии в клинической лаборатории: под ред. В.В. Меньшикова. M.: Агат-Мед, 2003. С. 13-14.