В статье приведены методы обнаружения и количественного определения азалептина в трупном материале при химикотоксикологической экспертизе с использованием тонкослойной хроматографии, УФ-спектрофотометрии.
Лекарственный препарат азалептин (клозапин, лепо- некс) по фармакологической классификации относится к психотропным лекарственным средствам, действующим на центральную нервную систему, к группе нейролептиков. Азалептин оказывает выраженное антипсихотическое и седативное действие. Препарат показан при острых и хранических формах шизофрении, психозах, и других пограничных состояниях [1,6].
Азалептин производное пиперазино-дибензодиазепина, по химической структуре является трициклическим соединением. Химическая формула:
⑈18Н19⑈1Ñ4[3]. Азалептин - порошок зеленовато-жёлтого цвета, практически нерастворим в воде, малорастворим в эфире, умеренно растворим в 95% этиловом спирте, легкорастворим в хлороформе. Промышленностью РФ выпускаются таблетки азалептина в дозировке 0,025 и 0,1г., хранение список Б [3].
Случай из практики. В марте 2011года женщина 1961г.р. скончалась в реанимационном отделении 3-ей городской больницы Петропавловска СКО. Острое медикаментозное отравление тяжёлой степени тяжести. Суицид. Осложнения: токсическая энцефалопатия, отёк головного мозга, двухсторонняя гипостатическая пневмония. Проведено 9 койко-дней. Анамнез: в алкогольном опьянении с целью суицида после ссоры с мужем приняла 20 таблеток элениума, 50 таблеток азалептина.
Материал и метод. В литературе описан ряд случаев отравления азалептином и опубликованы отдельные методики судебно-химического исследования биологического материала [2,4,5]. С целью обнаружения сильнодействующих веществ, в частности азалептина (элениум определила по цветным реакциям, по соответствию Rf свидетелю в различных системах растворителей, УФ-спектру, дала количественную оценку содержания в крови методом УФ- спектрофотометрии), произведено исследование трупного материала (частей внутренних органов и биологических жидкостей). Изолирование из частей внутренних органов (ткани печени, стенки желудка) проводили по методу Стаса-Отто, для этого по 50г тканей органов настаивали с этанолом, после осаждения белков проводили изолирование эфиром из кислой среды при реакции среды 2,0, затем хлороформом из щелочной среды при при рН 9,0-10,0, после концентрирования органических фаз количественно переносили в мерные колбы на 25мл с соответствующей маркировкой. Изолирование из 10 мл крови, 10 мл мочи (после разбавления проб дистиллированной водой 1:1) проводили после подкисления раствором хлористоводородной кислоты.
Результаты исследования. Исследование объектов проводили путём скрининга методом ТСХ в системах органических растворителей различного состава и полярности с обработкой хроматографических пластин различными визуализирующими растворами. Идентификацию выделенного из биообъектов азалептина проводили по соответствию параметров Rf пятен стандартному раствору азалептина: по наблюдаемым пятнам зеленовато-жёлтого цвета при дневном свете, по поглощению тёмно-синего цвета в УФ-свете (254нм), цветным реакциям с реактивом Либермана (пятна жёлто-коричного цвета), с концентрированной азотной кислотой (пятна с переходом от жёлтого через красноватый до коричневого), с реактивом Эрдмана (пятна жёлтого цвета). С реактивами Марки, Фреде, концентрированной серной кислотой, раствором хлорида окисного железа окрашиваний не наблюдали. Хроматографическое исследование осуществляли восходящим способом на хроматографических пластинках «Сорбфил» (тип сорбента-силикагель СТХ-1А) с пробегом фронта растворителей 10см, в качестве подвижной фазы использовали следующие системы:
|
№ |
Системы |
Rf |
|
I |
этилацетат:хлороформ:25%раствор аммиака(85:10:5) |
0,72 |
|
толуол:ацетон:25%раствор аммиака(50:50:1) |
0,52 |
|
|
III |
диоксан:хлороформ:ацетон:25%раствор аммиака(47,5:45:5:2,5) |
0,77 |
В качестве реактивов по проявлению хроматографических пластинок использовали модифицированный реактив Драгендорфа (пятна ярко-оранжевого цвета на жёлтом фоне), подкисленный раствор перманганата калия (пятна жёлто-коричневого цвета на фиолетовом фоне). При хроматографическом исследовании обнаруженное вещество располагалось параллельно стандартному образцу азалептина и проявлялось соответствующими реактивами с аналогичными окрасками в системах. После проведения изолирования действующего вещества из средней пробы трупного материала в щелочных извлечениях печени, почки, крови при исследовании методом ТСХ наблюдали пятна, совпадающие по значениям Rf с веществом азалептином, который был использован вкачестве «свидетеля». Подтверждающее исследование проводили методом УФ-спектрофотометрии. Выделенный из трупного материала азалептин идентифицировали по соответствию его УФ-спектра параметрам стандартного образца. УФ-спектры исследуемых образцов из биообъектов и раствора азалептина (10мкг/мл) в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты имели аналогичный характер спектральной кривой (рис.1). При проведении спектрофотометрического исследования на спектрофотометре марки «Спекорд205» в диапазоне длин волн220-320нм, в кювете с длиной оптического пути10мм отмечались максимумы абсорбции при длинах волн240 и λ=300нм (плато), минимум при длине волны 227 нм раствор сравнения 0,1М раствор хлористоводородной кислоты).
Количественную оценку азалептина в трупном материале (внутренниие органы и биологические жидкости) определяли по калибровочному графику спектрофотометрическим методом на «Спекорд205», раствором сравнения служила 0,1М хлористоводородная кислота. Определение их проводили после предварительной хроматографической очистки на пластинке покрытой слоем силикагеля. Элюировали 10 мл 0,1М хлористоводородной кислоты. Для приготовления стандартного раствора 0,1г азалептина растворяли в мерной колбе емкостью 100 мл в 0,1М хлористоводородной кислоты. 10мл полученного раствора переносили в мерную колбу на 100мл, объем доводили до метки 0,1н раствором серной кислоты (100мкг/ мл). По 20, 10 и 5мл полученного раствора переносили в мерные колбы на 100мл, объемы доводили до метки 0,1М хлористоводородной кислоты. В 1мл полученных стандартных растворов содержится 0,02мг, 0,01мг и 005мг азалептина. Расчет содержания азалептина производили по стандартному раствору, содержащему 100мкг азалептина в 1мл 0,1М хлористоводородной кислоты при длине волны 240нм. Формула для расчета азалептина:
Duucc.xCcm.x50 .∖'I00
Dcc ..∖'lλ'I0.∖'I000
где Х – содержание азалептина в 100г биологического материала (в мг);
⑉ст. - оптическая плотность стандартного раствора;
Dиссл. - оптическая плотность исследуемого раствора;
V - объём хлороформного извлечения, взятый для анализа, мл;
Сст. - концентрация азалептина в стандартном растворе (100мкг/мл);
50 - общий объём хлороформного извлечения, мл;
100/10 - пересчет на 100г биологического материала; 1000 - перевод мкг в мг.
Выводы:
При использовании метода изолирования азалептина из трупного материала подкисленным спиртом получаются хорошо очищенные извлечения, которые можно исследовать при химико-токсикологической экспертизе. Из мочи азалептин изолируется после подкисления соляной кислотой достаточно полно. Из крови азалептин изолируется плохо по причине связывания с белками плазмы на 95%(1).
Азалептин обнаруживается по цветным реакциям, по соответствию Rf «свидетелю» в различных системах растворителей, УФ - спектру.
Количественную оценку содержания азалептина, выделенного из биологического объекта, можно проводить с помощью УФ - спектрофотомерии.
Литература:
- Государственный реестр РФ лекарственных средств.-М.,2004- Т.2.-С.729-730.
- Козлов И.С., Ефимов А.П., Симонова Н.С., Тарасова В.Н.//Суд.- мед.эксперт.-1986.-С.43- 44.
- Машковский М.Д.Лекарственные средства: Пособие для врачейюХарьков,1997.-Т.1.-.68-69.
- Мелентьев А.Б., Курочкин И.В.// Суд.-мед.эксперт.-1999.-№4.- С.27-29.
- Невинный В.И., Вольграм Б.Н. Суд.-мед.эксперт.-1987.№2.- 59-61.
- Справочник Видаль (Лекарственные препараты в России).- М.,2000.-С.Е84-Е85.
- Clarke s Isolation and Identification of Drugs.-London,1986.-R488- 489.