Современный подход к анализу олигопептидов методом вэжх-мс/мс

Лекарственные средства пептидной природы обладают избирательным действием, оказывают фармакологический эффект при низких концентрациях в крови, к тому же считаются относительно безопасными для применения [1]. В настоящее время препараты пептидной природы приобретают все большее распространение на рынке, проводятся их клинические и доклинические исследования фармакокинетики, что в свою очередь требует создания соответствующих биоаналитических методик. При определении пептидов в биологических образцах требуется высокая чувствительность методики, так как данные вещества обычно активны в низких концентрациях. В свою очередь при работе с биологическими образцами, имеющими сложный состав, необходима высокая селективность аналитического метода. В связи с вышесказанным для определения пептидов часто используется метод ВЭЖХ-МС/МС.

Данное исследование посвящено решению проблем, возникающих при разработке методики количественного определения олигопептидов методом ВЭЖХ-МС/МС. Во-первых, большая молекулярная масса олигопептида (до 10 000 Да) не всегда позволяет определить однозарядные ионы исследуемого вещества, поскольку верхний предел сканирования отношений m/z составляет около 2000 для наиболее распространенных квадрупольных масс-анализаторов. Во-вторых, молекулы олигопептидов довольно часто обладают большим количеством кислотных и основных центров, что обеспечивает многообразие n-зарядных ионов при ионизации электрораспылением [2]. В-третьих, молекулярные ионы олигопептидов не всегда склонны к фрагментации при столкновении с атомами инертного газа (Collision-induced dissociation – CID) из-за эффективной делокализации заряда и устойчивых внутримолекулярных связей, что затрудняет использование высокоселективного режима детектирования путем мониторинга множественных реакций (multiple reaction monitoring, MRM) [3]. Также следует отметить гидрофильную природу многих олигопептидов, что осложняет выбор условий разделения методом обращенно-фазовой хроматографии. Целью данного исследования была демонстрация способов решения обозначенных проблем на примере тетрадекапептида(треонил-глутамил-лизил-лизил-аргинил-аргинил-глутамил- треонил-валил-глутамил аргинил-глутамил-лизил-глутамата).

Теоретически рассчитанная молекулярная масса исследуемого тетрпдекапепида составила 1818,02 Да. Получен масс-спектр нативного тетрадекапептида при ионизации электрораспылением. Наблюдается ряд n- протонированных квазимолекулярных ионов, значения m/z которых рассчитываются по формуле: m/z = (M + nH+) / n, что полностью согласуется с теоретически рассчитанными для исследуемого вещества (909,9, 607,0, 455,5, 364,6) (рис.1).

A

b

Рисунок 1. Масс-спектр нативного вещества (a) и пропионилированного производного(b) при положительной ионизации электрораспылением.

Вместе с тем, данные ионы практически не подвергаются фрагментации в ячейке соударений, что исключает работу в режиме MRM, поэтому было принято решение о проведении дериватизации исследуемой молекулы. В качестве дериватизирующих агентов были рассмотрены: дансилхлорид, тозилхлорид, фенилизотиоционат (ФИТЦ), пропионовый ангидрид [4]. Для всех производных были получены масс-спектры, согласующиеся с теоретическими расчетами.

Все производные в отличие от нативного пептида демонстрировали хорошее удерживание на колонке с сорбентом С18, поскольку в дериватизации участвуют аминогруппы, и продукты замещения обладают более высокой липофильностью. Однако, обнаружено, что дансилированные производные тетрадекапептида практически не подвергаются фрагментации, как и нативная форма. В случае тозилированных и ФИТЦ- производных удалось достигнуть незначительной фрагментации ионов, но при этом был затруднён контроль полноты протекания дериватизации в модельных образцах плазмы крови.

Лучшие результаты были получены при взаимодействии тетрадекапептида с пропионовым ангидридом. При этом для модельного образца плазмы крови удалось подобрать условия реакции, исключающие получение 3-замещённых производных в пользу 4-замещённых. В результате проведенной работы удалось достичь CID-фрагментации 4-пропионилированного производного тетрадекапептида, что позволило подобрать и оптимизировать условия детектирования в MRM-режиме.

Таким образом, изучены особенности хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования тетрадекапептида, а также продуктов его взаимодействия с дансилхлоридом, тозилхлоридом, ФИТЦ-реагентом и пропионовым ангидридом. Установлено, что наиболее перспективна для разработки биоаналитической методики дериватизация тетрадекапептида пропионовым ангидридом.

 

Список литературы

  1. Бабина С.А. Желтышева А.Ю., Шуклин Г.О., Шуклина А.А., Япаров А.Э., «Лекарственные средства на основе пептидов: применение, технологии получения,» Международный студенческий научный вестник, № 3, pp. 21-21, 2019.
  2. Miladinović SM, Fornelli L, Lu Y, Piech KM, Girault HH, Tsybin YO, «In-spray supercharging of peptides and proteins in electrospray ionization mass spectrometry,» Analytical chemistry, № 84(11), pp. 4647-51, 2012.
  3. Ciccimaro E, Ranasinghe A, D’Arienzo C, Xu C, Onorato J, Drexler DM, Josephs JL, Poss M, Olah T., «Strategy to improve the quantitative LC-MS analysis of molecular ions resistant to gas-phase collision induced dissociation: application to disulfide-rich cyclic peptides,» Analytical chemistry, № 86(23), pp. 11523-7, 2014.
  4. Koller M, Eckert H., «Derivatization of peptides for their determination by chromatographic methods,» Analytica chimica acta, № 352(1-3), pp. 31-59, 1997.
Год: 2021
Город: Шымкент
Категория: Медицина