Регулирование обращения лекарственных средств (ЛС) путём создания грамотной нормативноправовой базы всегда было и остаётся актуальной задачей здравоохранения. В настоящее время в рамках Евразийского экономического союза (ЕАЭС) на межгосударственном уровне наблюдается стремление к гармонизации подходов к проведению исследований биоэквивалентности (БЭ) лекарственных препаратов. Важнейшим результатом этих усилий стало утверждение "Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза" [1], в которых, в частности, отражены рекомендации по проведению валидации биоаналитических (БА) методик. Данный документ, несомненно, можно признать большим шагом вперёд по сравнению с бывшими актуальными ранее в Российской Федерации рекомендациями по валидации биоаналитических методик, изложенными в "Руководстве по экспертизе лекарственных средств" [2]. Вместе с тем следует отметить, что многие положения нормативно-правовой базы требуют обсуждения и разъяснений, в особенности когда речь заходит об использовании метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-селективным детектором (ВЭЖХ-МС/МС).
В последнее время распространение современного оборудования привело к тому, что некоторые исследователи решили, что при наличии масс-спектрометрического детектирования (МСД) хроматографическое разделение отходит на второй план и едва ли требуется. Более того, эти мифы теперь начинают широко пропагандироваться как достоинство метода [3]. Но, исходя из практических наработок, нам бы хотелось предостеречь научный мир от этих заблуждений.
Одной из важнейших характеристик БА методики, которая устанавливается в ходе валидации в первую очередь, является её селективность - способность БА методики определять и различать исследуемое анализируемое вещество и внутренний стандарт в присутствии компонентов, которые могут содержаться в образце.
Укоренилось заблуждение, что ВЭЖХ-МС/МС при детектировании в режиме мониторинга множественных реакций (multiple reaction monitoring, MRM) позволяет достигнуть едва ли не абсолютной селективности, является «панацеей» и избавляет исследователя от необходимости тщательной разработки методики пробоподготовки и хроматографического разделения. Возможно, такой подход окажется оправданным в ряде ситуаций, однако опыт проведения БА исследований показывает, что при работе с реальными образцами от добровольцев/пациентов возникают ситуации которые невозможно смоделировать на ранних этапах разработки методики. Например, при определении нифедипина в сыворотке крови методом ВЭЖХ-МС/МС с детектированием в режиме MRM на хроматограмме образца интактной сыворотки крови с добавлением стандартного раствора анализируемого вещества наблюдается один пик (Рис. 1), соответствующий нифедипину ("красный пик"). В то же время, при анализе образца сыворотки крови, полученной от пациента, принимавшего нифедипин, на хроматограмме присутствуют уже два хорошо разделённых пика (Рис. 2). Как оказалось в дальнейшем, "лишний" пик на хроматограмме ("синий пик") во втором случае соответствует метаболиту, имеющему ту же молекулярную массу, что и целевое соединение и аналогичный путь фрагментации. Очевидно, что отсутствие эффективного хроматографического разделения в этой ситуации привело бы к недостоверным результатам исследований.
Биообразцы, как правило, не являются однородными по составу и качеству, например, может наблюдаться гемолиз крови, часто встречаются образцы с повышенным содержанием липидов, поэтому, проводя разработку и валидацию методики, данные факты необходимо принимать во внимание, т.к. различие в составе и качестве биообразцов сказывается не только на селективности методики, но и на степени извлечения аналита и эффекте матрицы.
Эффект матрицы – прямое или непрямое влияние или воздействие на результаты анализа, обусловленные наличием в биологическом образце непредусмотренных анализом анализируемых веществ или иных влияющих на него веществ. Данная характеристика оценивается только при использовании МСД и до недавнего времени в руководствах методология её определения описывалась недостаточно чётко и понятно, что приводило к ошибкам. Однако в Правилах ЕАЭС вслед за передовыми научными коллективами [4] определение эффекта матрицы изложено достаточно чётко.
Наибольшие споры вызывают требования, предъявляемые к нижнему пределу количественного определения (НПКО) методики, который, согласно Правилам ЕАЭС, необходимо адаптировать к ожидаемым концентрациям и цели исследования (например, в исследовании биоэквивалентности НПКО не должен быть выше, чем 5 % от максимальной концентрации на фармакокинетической кривой (Cmax), а точнее минимальной величины Cmax из всей выборки субъектов). Данное требование едва ли выполнимо и теряет всякий смысл, когда речь заходит об анализе ЛС с высокой вариабельностью фармакокинетики (Рис. 3). В приводимом примере пациентам, принимающим одинаковый препарат в одинаковой дозе проводили терапевтический лекарственный мониторинг, и получилось, что у кого-то Cmax составил порядка 150 нг/мл, а у кого-то едва привысил 3 нг/мл. В соответствии с Правилами, НПКО методики должен быть валидирован на уровне 3/20 = 0,15 нг/мл, в то время как ни в одной пробе от пациентов не наблюдалась концентрация ниже 1 нг/мл, что и являлось реальным валидированным НПКО, таким образом в данной ситуации и для данной задачи требования Правил избыточны. По нашему мнению, вопрос о планировании НПКО методики должен тщательно прорабатываться в каждом конкретном случае с учётом дизайна исследования и всех доступных данных о фармакокинетике определяемого вещества.
детектора остаётся линейным пусть и в широком, но в ограниченном диапазоне концентраций определяемого вещества (Рис. 4). Например, в случае ВЭЖХ с МСД при ионизации вещества методом электораспыления (ESI) важно учитывать, что выше определённой концентрации аналита процесс ионизации достигает насыщения и протекает с меньшей интенсивностью. Таким образом, нельзя бесконечно расширять аналитический диапазон методики, например, пытаясь снизить НПКО.
С НПКО тесно связана другая характеристика БА методики – аналитический диапазон – интервал между высокой и низкой концентрацией (содержанием) анализируемого вещества в образце (включая указанные концентрации), для которых показано, что аналитическая методика удовлетворяет требованиям по прецизионности, правильности и постоянству функции отклика. Стоит помнить о том, что отклик
Таким образом, всегда следует помнить, что проведение исследований с использованием ВЭЖХ- МС/МС является научно- исследовательской работой, требующей высококвалифицированных специалистов и больших затрат на материально-техническое обеспечение. Только вдумчивый научноориентированный подход позволит проводить первоклассные исследования мирового уровня и обеспечит надлежащее качество ЛП.
Список литературы
- Правила проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза. Утверждены распоряжением №178 Коллегии Евразийской экономической комиссии от 25.12.2015 г
- Руководство по экспертизе лекарственных средств. Под.ред. проф. А.Н. Миронова. Том I. - М.: Гриф и К, 2013. - 328 с
- Васильева М.В. Жидкостная хроматография и капиллярный электрофорез сердечно-сосудистых лекарственных средств: диссертация … кандидата химических наук: 02.00.02; [Место защиты:Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского] — Саратов, 2017. — С. 31.
- Matuszewski B. K., Constanzer M. L., Chavez-Eng C. M. Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC- MS/MS //Analytical chemistry. – 2003. – Т. 75. – №. 13. – С. 3019-3030.