Saccharomyces cerevisiae на сегодня самый известный и широко используемый организм в производстве различных продуктов питания, включая хлеб, различные алкогольные напитки, в том числе вино, пиво и ряд ферментированных напитков. Saccharomyces cerevisiae var. boulardii имеет близкие морфологические и биохимические характеристики [1]. Среди отличительных особенностей очевидным различием между ними является необычно высокий оптимальный рост Saccharomyces cerevisiae var. boulardii соответствующий температуре 37 ° C, которая очень близка к температуре тела человека. А также другой важной особенностью является более высокая выживаемость при низком кислотном значении рН [2].
Из различного растительного сырья, произрастающего в Туркестанской области, выделено 180 различных видов дрожжей, большинство относятся Saccharomyces 159 и только 21 культуры к Dipodascaceae, чистых культур выделено 71.
Культурально-морфологические свойства Saccharomyces cerevisiae–Az- 12 (из гранатового сока): Колонии на солодовом сусле-агаре небольшие, гладкие, выпуклые, с ровными краями. Средний размер клеток составляет 5,0 × 6,4 мкм. Форма клеток в основном округлая. Размножается почкованием.
Физиолого-биохимические свойства. Сбраживает: глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, мальтотриозу, не использует галактозу, в небольшом количестве потребляет пентозы — арабинозу, ксилозу и рибозу, в качестве источника углерода могут использовать многие простые соединения глицерин, в результате сбраживания сахаров образует CO2 и этиловый спирт.
Особенности роста: Температурный оптимум 37±1°С. Клетки растут в пределах от 5°С до 45°С. Оптимальное значение pH среды 3,5-5,5. Сохраняет жизнеспособность в диапазоне pH от 1,2 до 10. Растет при содержании желчи в среде до 3,0%.
Saccharomyces cerevisiae Az- 12 является устойчивым к гентамицину, оксациллину, цефазо- лину, амоксиклаву, тетрациклину, норфлоксацину, ванкомицину, эритромицину, цефотаксиму, ципрофлоксацину, цефуроксиму, метронидазолу, кетоназолу, амфотерицину. Проявляют выраженные антагонистические свойства по отношению к Е. coli.
Молекулярно-генетическую идентификацию микроорганизмов проводили методом секвенирования по Сенгеру. Геномную ДНК из 1 суточных культур выделяли с помощью набора для выделения ДНК из растений/грибов «Plant/Fungi DNA Isolation Kit» компании Norgen Biotek Corp. (Канада) согласно протоколу4 производителя. Концентрацию ДНК в образцах определяли с помощью флуориметра Qubit (Invitrogen, США) по шкале для dsDNA HS.
В работе использовались универсальные праймеры ITS-региона дрожжей: ITS1 (5,- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3,) и ITS 2 (5,-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3,). Реакционная смесь для амплификации состояла из: 12,5 мкл Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix, 1,25 мкл Forward праймер (10 мкМ), 1,25 мкл Reverse праймер (10 мкМ), 1,5 мкл ДНК и 8,5 воды. Общий объем ПЦР - смеси составлял 25 мкл. ПЦР c универсальными праймерами проводили на амплификаторе Eppendorf при режиме амплификации: 94ºС – 30 сек; 55ºС – 1 мин; 72ºС – 40 сек – всего 30 циклов; 72ºС – 10 мин. Продукты ПЦР окрашивали и вносили в 1,2% агарозный гель. Визуализировали в УФ- трансиллюминаторе.
Реакцию секвенирования проводили с применением BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applide Biosystems) согласно инструкции производителя [BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Protocol Applied Biosystems США], с последующим разделением фрагментов на автоматическом генетическом анализаторе 3500 DNA Analyzer (Applide Biosystems). Результаты секвенирования обрабатывали в программе SeqА (Applide Biosystems). Полученные нуклеотидные последовательности ITS-региона ДНК грибов были подвергнуты сравнению с данными базы Gene Bank (www.ncbi.nih.gov), с помощью программы BLAST. Филогенетический анализ проводили с использованием программного обеспечения MEGA6. Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили, используя алгоритм ClustalW. Для построения филогенетических деревьев использовали метод «объединения соседей» Neiighbor-Joining (NJ). В результате амплификации с IТS- праймерами получен ПЦР-продукт размером около 550 bp.
Результаты анализа последовательностей ITS гена у изучаемых штаммов представлены в виде филогенетических деревьев, построенных в программе MEGA 6, с использованием Neiighbor-Joining кластерного метода расчета генетических расстояний.
Последовательность нуклеотидов:
TTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCA GCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAAC GGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGG AGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAAC ACAAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTT AAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAA TGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCC CCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAG
Степень гомологии со штаммом MH608341.1 Saccharomyces cerevisiae isolate extr03 составила 100%.
Таким образом, существует потребность в ценных молекулярно генетических исследованиях, способных различать штаммы и устанавливать соответствующие методы идентификации пробиотических штаммов S. cerevisiae var. boulardii, при этом очень важный шаг – это найти функциональную связь между конкретной ДНК и пробиотическим действием.
Использованная литература:
- H. Kumura, Y. Tanoue, M. Tsukahara, T. Tanaka, K. Shimazaki, Screening of dairy yeast strains for probiotic applications, J. Dairy Sci. 87 (2004) 4050–4056.
- McFarland LV. Systematic review and meta-analysis of Saccharomyces boulardii in adult patients. World journal of gastroenterology: WJG. 2010;16(18):2202-22. Epub 2010/05/12.