Разработка состава лекарственной формы с бактериофагом

Аннотация

В статье представлены результаты по разработке состава лекарственной формы с бактериофагом стафилококковым для лечения ЛОР-заболеваний. В результате биологических исследований in vitro провели титрование бактериофага стафилококкового с целью установления титра специфической активности в отношении тест-культуры Staphylococcus aureus АТСС 25293. Изучили антимикробную активность и определили минимальные ингибирующие разведения по отношению к разным тест- культурам микроорганизмов препаратов эктерицид и димексид, как перспективных компонентов разрабатываемой комбинированной лекарственной формы.

Ключевые слова: бактериофаг стафилококковый, антимикробная активность, ЛОР-заболевания, лекарственная форма.

В современной клинической практике прослеживается отчетливая тенденция к изменению возбудителей ЛОР-заболеваний и увеличению количества штаммов микроорганизмов, резистентных к антибактериальной терапии. Возможной альтернативой антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам являются бактериофаги с широким спектром антимикробной активности, подавляющие как чувствительные так и антибиотикоустойчивые штаммы бактерий. Следует отметить, что вирусы бактерий, активные в отношении многочисленных возбудителей гнойно-воспалительных процессов, которые вызывают респираторные, кишечные и урогенитальные инфекции, известны с начала ХХ века [2, 6]. Инфекции ЛОР-органов представляют собой группу наиболее распространенных острых заболеваний и эпидемиологические исследования свидетельствуют о неуклонном их росте. Прежде всего, речь идет об остром и хроническом ринитах, фарингите, тонзиллите, синусите, наружном и среднем отите. Большая часть инфекций ЛОР-органов приходится на вирусные заболевания и сопровождается присоединением вторичной бактериальной инфекции. Основными бактериальными возбудителями острых инфекций в оториноларингологии являются: Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes и др. При хронической гнойной патологии чаще всего встречаются микробные ассоциации. Помимо распространения антибиотикорезистентности у возбудителей заболеваний ЛОР-органов определенную проблему составляет увеличивающаяся частота аллергических реакций на введение антибиотиков. Поэтому на сегодняшний день особую актуальность приобретает применение альтернативных антибактериальных средств. Одним из перспективных путей решения этой проблемы является своевременное использование бактериофагов, а именно разработка состава и технологии лекарственных форм на основе бактериофагов [4, 5, 6].

На кафедре биотехнологии Национального фармацевтического университета проводят исследования по разработке состава и технологии лекарственной формы с бактериофагом стафилококковым для профилактики и лечения ЛОР-заболеваний. Для расширения спектра антимикробного действия лекарственной формы с бактериофагом, что обусловлено этиологией заболеваний ЛОР-органов, необходимо провести исследования по выбору активных фармацевтических ингредиентов (АФИ) для создания комбинированной лекарственной формы.

Цель исследования. Изучение специфической активности бактериофага стафилококкового и противомикробной активности АФИ - эктерицида и димексида для дальнейшей разработки состава лекарственной формы с антимикробным действием для профилактики и лечения заболеваний ЛОР- органов.

Материалы и методы. Объектами исследования были выбраны бактериофаг стафилококковый, эктерицид и димексид (диметилсульфоксид). Бактериофаг стафилококовый - прозрачная жидкость желтого цвета. Раствор бактериофага стафилококкового содержит стерильный фильтрат фаголизата стафилококков - вирионов стафилококкового бактериофага и используется для лечения инфекций, вызванных патогенными штаммами стафилококка золотистого. Димексид - бесцветная, прозрачная жидкость со специфическим запахом. Препарат способен проникать сквозь биологические мембраны и кожные покровы, повышая растворимость и всасывание лекарственных веществ клетками. Обладает умеренным антисептическим эффектом. Эктерицид (продукт окисления рыбьего жира) - прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом. Проявляет антибактериальную активность по отношению к пиогенной микрофлоре: синегнойной и кишечной палочкам, протею, стафилококкам.

Все исследования выполняли в асептических условиях, используя ламинарный бокс (кабинет биологической безопасности АС2-4Е1 «Esco», Индонезия). При изучении специфической активности бактериофага стафилококкового использовали метод Аппельмана [3]. Принцип метода заключается в приготовлении ряда десятикратных разведений бактериофага стафилококкового и определения активности бактериофага по отношению к тест-культуре Staphylococcus aureus АТСС 25293. Титр бактериофага определяли по разведению в последней пробирке, в которой наблюдается четко выраженный лизис культуры.

Антимикробное действие препаратов эктерицид и димексид исследовали методом двукратных серийних разведений in vitro в жидкой питательной среде [1]. В качестве тест-микроорганизмов использовали чистые культури з Американськоі' колекціі культур (АТСС): грамположительные бактерии Staphylococcus aureus АТСС 25293 и споровая культура Bacillus subtilis АТСС 6633, грамотрицательные культуры Escherichia coli АТСС 25922 и Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Наличие противогрибковой активности проверяли по отношению к дрожжеподобному грибу Candida albicans АТСС 885-653. Микробная нагрузка составляла 107 колониеобразующих единиц микроорганизмов в 1 мл физиологического раствора (КОЕ/мл). Учет результатов проводили визуально по наличию или отсутствию мутности среды в пробирках. Разведение образца в последней пробирке с прозрачной средой (отсутствие видимого роста тест-штамма) соответствует минимальному ингибирующему разведению препарата.

Результаты и обсуждение. При изучении специфической активности бактериофага стафилококкового по методу Аппельмана в ряд пробирок вносили по 4,5 мл жидкой питательной среды (мясопептонный бульон), в первую пробирку стерильной пипеткой добавляли 0,5 мл бактериофага, перемешивали содержимое пробирки и 0,5 мл переносили во вторую пробирку и т.д. После этого в каждую пробирку вносили по 0,1 мл приготовленной взвеси тест-культури Staphylococcus aureus АТСС 25293. Все пробирки помещали в термостат и инкубировали при температуре 32,5±2,5 °С на 18-20 часов.

При проведении исследований по изучению противомикробной активности эктерицида и димексида методом двукратных серийных разведений использовали односуточные суспензии бактериальных культур и двухсуточную культуру дрожжеподобного гриба в физиологическом растворе. Микробная нагрузка составляла 107 колониеобразующих единиц микроорганизмов в 1 мл физиологического раствора (КОЕ/мл). В каждую пробирку с разведениями образцов и в контроль роста тест-культур вносили по 0,1 мл микробной взвеси тест-штамма. При работе с бактериальными культурами в качестве жидкой питательной среды использовали мясо-пептонный бульон, при работе с культурой дрожжеподобного гриба - бульон Сабуро. Пробирки с посевами помещали в термостат для инкубации - бактериальные культуры при температуре 32,5±2,5 °С на 18-24 часа, культуру дрожжеподобного гриба при 22,5±2,5 °С на 48 часов.

В контрольных пробирках тест-микроорганизмов наблюдали наличие роста культур; в контроле питательной среды - отсутствие роста, то есть питательные среды стерильны.

В результате проведеных исследований по изучению противомикробных свойств исследуемых образцов по отношению к разным культурам микроорганизмов были получены результаты, которые представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Изучение антимикробной активности исследуемых образцов

Тест-культура

Титр бактериофага

стафилококкового (метод Аппельмана)

Минимальное ингибирующее

разведение (метод двукратных

разведений)

Димексид

Эктерицид

Staphylococcus aureus АТСС 25293

10-5

1/8

1/2

Bacillus subtilis

АТСС 6633

 

1/8

1/2

Escherichia coli АТСС 25922

 

1/8

1/2

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

 

1/8

1/8

Candida albicans

АТСС 885-653

 

1/16

1/2

Примечание. «-» - исследования не проводились

Результаты, полученные экспериментально и представленные в табл.1 показывают, что титр бактериофага стафилококкового составляет 10-5 по отношению к тест-штамму Staphylococcus aureus АТСС 25293. При изучении антимикробной активности димексида и эктерицида были установлении минимальные ингибирующие разведения (табл.1) в отношении всех используемых бактериальных культур, а именно: Staphylococcus aureus АТСС 25293, Bacillus subtilis АТСС 6633, Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 и культуры дрожжеподобного гриба Candida albicans АТСС 885-653. Следует отметить, что данные исследуемые образцы АФИ обладают широким спектром антимикробной активности как в отношении грамположительных и грамотрицательных бактериальных культур, так и в отношении дрожжеподобного гриба рода Candida.

Выводы. В результате проведенных исследований определили титр специфической активности бактериофага стафилококкового, минимальные ингибирующие разведения димексида и эктерицида по отношению к бактериальным тест-культурам и дрожжеподобному грибу рода Candida. Таким образом, проведенные исследования показали перспективность работы, и дальнейшим этапом по разработке состава комбинированной лекарственной формы будет изучение возможного антимикробного синергизма при совместном использовании бактериофага стафилококкового и различных групп АФИ с противомикробным действием.

Литература

  1. Вивчення специфічноі' активності протимікробних лікарських засобів: Метод. реком./ Ю.Л. Волянський, І.С. Гриценко, В.П. Широбоков і інш. - Киів, 2004. - 38 с.
  2. Красильников И.В. Краткий обзор современного состояния и перспективных направлений развития производства и применения лечебно-профилактических препаратов бактериофагов / И.В. Красильников, А.К. Лобастова, К.А. Лыско // Вестн. биотехнол. им. Ю.А. Овчинникова. - 2010. - №2. - С.28-33.
  3. Медицинские лабораторные технологии: руководство по клинической лабораторной диагностике: в 2 т./ [В.В.Алексеев и др.]; под ред. А.И.Карпищенко. - 3-е изд., перераб. и доп. - Т. 2. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - С.423.
  4. Носуля Е.В. Перспективы применения бактериафагов в оториноларингологии / Е.В.Носуля // Вестник оториноларингологии. - 2015. - №1. - С. 80-83.
  5. Шеремет М.П. Використання препаратів на основі бактеріофагів для лікування лор-органів / М.П. Шеремет, О.П. Стрілець, Л.С. Стрельников // Промислова фармація: Етапи становлення та майбутне: збірник наукових праць. - Х.: Вид-во НФаУ, 2017. - С.132-134.
  6. Bacteriophage therapy: a revitalized therapy against bacterial infections diseases / S. Matsuzaki, M. Rashel, J. Uchiyama et al.// J Infect Chemother. - 2005. - №11(5). - Р. 211-219.
Год: 2017
Город: Шымкент
Категория: Медицина