Питательная среда, как важный аспект в получении культуры растений биотехнологическим методом

Биотехнология (от греческих слов bios - жизньДекеи - искусство, logos - слово, учение, наука) - область науки и практики, основанная на направленном использовании биологических объектов для получения полезных продуктов. Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы, простейшие организмы, клетки (ткани) растений, животных и человека и их метаболиты, в частности биополимеры - ферменты, нуклеиновые кислоты и др.[1]

Как известно, само понятие «биотехнология» - это собрание технологий, использующих свойства клеток, например их способность синтезировать различные вещества, и заставляющих биологические молекулы, такие как ДНК и белки, работать на достижение заданных целей, в частности для получения фармацевтических субстанций. Традиционной и одновременно самой старой методикой, применяемой в биотехнологии для производства лекарственных препаратов, является ферментация, при которой используют живые клетки или их молекулярные компоненты.[2]

Культуры растительных клеток являются важным источником природных ЛС. Запасы растительного сырья в природе истощаются, роль биотехнологии растений в будущем будет очень актуальным. Клетки растений можно выращивать в искусственных условиях на питательных средах неограниченно долго, при этом часть биомассы можно использовать для экстракции целевого продукта, а часть пересаживать на свежую питательную среду для возобновления культуры. Размножение и выращивание многих культур ограничивается природными факторами (климат, сезон, погода, почвенные условия), но в случае проращивания в лабораторных условиях биотехнологическим методом, природные факторы не могут повлиять. Главным фактором является питательная среда.

Питательные среды для культивирования клеток имеют сложный состав: макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, аминокислоты, фитогормоны. При соблюдении условий стерильности успех в культивировании клеток определяется, прежде всего, составом питательной среды. Внешними факторами, влияющими на культивирование клеток, являются температура, свет, осмотическое давление, аэрация.[3]

Биотехнология растений основана на методах культуры тканей. Для клеточных технологий с целью получения экономически важных веществ используется клеточная масса, потому что клетки in vitro сохраняют присущий им в растении биосинтетический потенциал. Благодаря тотипотентности растительной клетки создаются нетрадиционные технологии для растениеводства, облегчается и ускоряется селекция и размножение ценных растений, производится оздоровленный посадочный материал.

Растения содержат разнообразные вещества вторичного метаболизма, которые широко используются в медицине и народном хозяйстве. Клетки in vitro способны синтезировать эти вещества и независимо от факторов окружающей среды служить их источником круглый год. Культивируемые клетки способны осуществлять биотрансформацию, то есть синтезировать некоторые вещества из их дешевых и доступных предшественников. Факторами, влияющими на накопление клетками in vitro вторичных веществ, являются генотип растения, состав питательной среды, условия культивирования.[4]

Нами проводятся исследования по получению лекарственных средств биотехнологическим методом. Материалы и методы. Обьектами исследований выбраны: семена лекарственных растений Шалфей лекарственный (Salvia officinalis L.) и Валериана лекарственная. (Valeriana officinalis).

В качестве питательных сред для проращивания культуры растений нами выбраны: среда Мурасиге- Скуга (базовая среда), простая агаровая среда.

Поверхностные покровы всех органов растений обычно загрязнены спорами различных микроорганизмов и грибов.

Основным условием успешного выращивания является стерилизация растительных объектов, которая заключается в уничтожении грибных и бактериальных спор на внешней поверхности без повреждения внутренних тканей. Для этого используют различные стерилизующие вещества.[5] Стерилизация семян. Вид стерилизующего вещества, его концентрация и длительность применения зависят от плотности и чувствительности ткани, которая будет стерилизоваться. Правильный выбор стерилизующей вещества состоит в том, чтобы она пагубно действовала на все микроорганизмы и в то же время минимально повреждала ткани. Еще одним важным условием является то, что стерилизующее вещество должно легко удаляться из ткани промывкой очищенной водой или разлагаться. Иначе происходит отравление тканей, что негативно влияет на образование и рост экспланта.

Как правило, стерилизацию начинают с погружения растительного материала в 70% этанол: семена - на 1-5 мин. Обработка тканей этанолом разрушает восковой налет на листьях, усиливает действие (проникновение) стерилизующих веществ. Детергент добавляют для смачивания поверхности: 6570% спирт действует как детергент и стерилизатор.

Стерилизацию изучаемых нами объектов проводили в стерильных химических стаканах, накрытых чашками Петри. Очищенный и промытый растительный материал в боксе на 1-2 мин поместили в стакан с 70% спиртом, затем стерильным пинцетом вынимали и переносили в стерильных условиях, после которого отмывали в 3-5 порциях стерильной дистиллированной воды.

Стерилизация посуды. Особое внимание требует стерилизация посуды и других вспомогательных веществ, от чистоты которых зависит микробиологическая чистота в процессе посева и проращивания. Вначале посуду тщательно моют с использованием детергентов. Вымытую посуду ополаскивают очищенной водой и высушивают в сушильном шкафу. Чтобы избежать заражения простерилизованных предметов из воздуха, перед стерилизацией их заворачивают в оберточную бумагу.

Затем посуду помещают в сушильный шкаф и прогревают при 160оС в течение 2 часов (с момента установки нужной температуры). За это время погибают не только бактерии, но и их споры. Температура выше 175оС недопустима, так как при этом ватные пробки буреют, а бумажные обертки становятся ломкими. Еще более строгой стерилизации можно добиться в автоклаве, поскольку влажный пар (120-125оС) под давлением губителен для микроорганизмов и их спор. Посуду (стаканы с крышками, чашки Петри, пипетки) заворачивают в фольгу или оберточную бумагу, сверху - в целлофан; верхнюю часть градуированных пипеток закрывают ватой, каждую заворачивают в бумагу. Автоклавируют под давлением 2 атм в течение 25 - 30 минут.

Стерилизация инструментов. Предварительная стерилизация инструментов (скальпелей, пинцетов, игл и т.д.) заключается в нагревании сухим горячим жаром в сушильном шкафу в течение 2 часов при температуре 140оС.

Стерилизация материалов. Вату, марлю, ватные пробки, фильтровальную бумагу, стерилизуют в автоклаве под давлением 2 атм в течение 25 - 30 мин.

Стерилизация питательных сред. Разлитые питательные среды автоклавируют при температуре 120оС и давлении 1 атм в течение 20 минут. [6]

После подготовки растительного сырья и вспомогательных материалов нами посажены простерилизованные семена в количестве 6 штук каждого вида растений в три чашки Петри.

Затем чашки Петри с содержимым поместили в термостат для проращивания при температуре 25оС. Экспланты проращивали в течении месяца при постоянном наблюдении.

Результаты и обсуждение.

Таблица 1 - Рост семян Шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.) и Валерианы

лекарственной. (Valeriana officinalis)

Результаты предварительных исследований приведены в таблице 1. Как видно из таблицы после одного месяца хранения в термостате, на среде Мурасиге-Скуга прорастание семян происходило лучше, на простой агаровой среде прорастание происходило медленно и образец сравнения не показал прорастаний.

Таким образом, полученные результаты показали, что наиболее оптимальной средой для проращивания семян Шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.) и Валерианы лекарственной (Valeriana officinalis) является среда Мурасиге-Скуга и для ускорения роста должны быть использованы фитогормоны (ауксины, цитокинин). Исследования по данному направлению продолжаются.

Литература

1. http://botanika.su/botanika-kak-nauka/kletochnaya-biotehnologiya/sposoby-sterilizatscii-rastitel-nyh- eksplantov.html