Аннотация
Цель работы: разработать методики качественного и количественного анализа комплексного препарата - суппозиториев с пробиотиками и кислотой молочной. Разработаны методики идентификации суппозиториев с лакто- и бифидобактериями и кислотой молочной. Методика качественного определения основана: для кислоты молочной - на химической цветной реакции с раствором кислоты серной и раствором меди сульфата; для микроорганизмов - на изучении морфологии колоний, выросших на плотной питательной среде, и характера роста в жидкой, а также на основании исследования клеток под микроскопом. Количественное определение осуществляли: для кислоты молочной - методом обратной алкалиметрии, используя в качестве индикатора фенолфталеин, для микроорганизмов - методом разведения с последующим высеванием на плотные питательные среды. Полученные результаты свидетельствуют о том, что все показатели находятся в пределах нормы, ошибка метода не превышает значения, заявленного в нормативной документации.
Ключевые слова: суппозитории, пробиотики, кислота молочная, технология, методики анализа
Эволюционно сформированные микробные популяции влагалищного биотопа играют важную роль в защите мочеполовой системы от условно-патогенной микрофлоры и специфических патогенов и поддержке репродуктивной функции, поэтому лечение дисбиотических нарушений, связанных с развитием инфекционно-воспалительных заболеваний, требует комплексного подхода, в частности использования лекарственных средств, имеющих в своем составе несколько действующих компонентов, которые нормализуют микрофлору урогенитального тракта и подавляют условно-патогенную и патогенную флору, потенцируя действие друг друга, и, тем самым, положительно влияя на репродуктивную функцию мочеполовой системы женщины [1]. Исходя из изложенного, следует отметить, что проблема создания комплексного препарата для восстановления вагинальной микрофлоры и одновременного предотвращения или лечения урогенитальных инфекций является важной и актуальной. На кафедре биотехнологии НФаУ разработан препарат для применения в акушерско-гинекологической практике, в котором как основные действующие компоненты были использованы пробиотические культуры лакто- и бифидобактерий и кислота молочная. На основании комплекса физико-химических, фармако-технологических, биофармацевтических, структурно-механических, микробиологических исследований был подобран оптимальный состав и технология суппозиториев, содержащих биомассу бифидо- и лактобактерий, кислоту молочную, твердый жир и твин-80 [2]. В данной работе представлены результаты исследований по разработке методик качественного и количественного анализа разработанного препарата.
При разработке методик качественного и количественного анализа суппозиториев были использованы физико-химические методы, рекомендованные государствен-ной фармакопеей Украины (ГФУ), а также классические методы высевания и идентификации микроорганизмов, широко используемые в микробиологической практике. Для определения количества живых клеток лакто- и бифидобактерий использовали метод серийных разведений с последующим высевом на плотную питательную среду. Количественное содержание кислоты молочной устанавливали методом обратной алкалиметрии, используя в качестве индикатора фенолфталеин; избыток щелочи оттитровывали кислотой соляной до обесцвечивания.
Обсуждения. Вагинальные суппозитории на гидрофобной основе контролируют по таким показателям качества: описание, идентификация, средняя масса и однородность массы, однородность содержания, распад или растворение, время полной деформации, температура плавления, микробиологическая чистота и количественное определение.
Для идентификации кислоты молочной в препарате использовали химическую цветную реакцию: к суппозиторной массе добавляли воду при нагревании и перемешивании, после чего - концентрированный раствор кислоты серной и раствор меди сульфата. Смесь перемешивали и нагревали на водяной бане в течение 5 мин при температуре 80 °С. Смесь охлаждали и добавляли раствор тиофена. Появление вишнево-красного цвета свидетельствовало о наличии кислоты молочной.
Идентификацию микроорганизмов лакто- и бифидобактерий видов L. fermentum или L. plantarum и B. bifidum проводили морфологически и микроскопически: при изучении роста микроорганизмов на питательных средах и по окраске по методу Грама. После расплавления суппозитория, соответствующего разведения и посева на жидкие и плотные селективные среды изучали морфологию выросших микроорганизмов.
На плотной питательной среде MRS штаммы L. fermentum образовывали колонии слабовыпуклые, полупрозрачные, сероватые; L. plantarum - выпуклые, непрозрачные белые колонии. На жидкой среде MRS-1 лактобактерии вырастали в виде равномерной мути и гомогенного белого осадка на дне пробирки. Штаммы В. bifidum - анаэробы, на поверхности плотных сред в аэробных условиях не росли. При росте на полужидких средах - печеночной среде Блаурокка, гидролизатно-молочном и казеиново-дрожжевом - на первые сутки вызвали равномерное помутнение среды, а через 2-3 суток образовывали разрыхленный осадок, оставляя прозрачной верхнюю часть среды (зона аэробиоза). Отдельные колонии бифидобактерий имели форму мелких «гвоздей» или «крошек» белого цвета, при встряхивании образовывали хрупкую массу.
Отдельные колонии микроорганизмов микроскопировали, для чего готовили препарат, фиксировали в пламени и окрашивали по Граму. Микроскопическая картина: лактобактерии представляли собой неподвижные грамположительные палочки длиной от 0,7 мкм до 3,0 мкм, расположенные беспорядочными скоплениями и отдельными короткими цепочками, жгутиков не имели, капсул и спор не образовывали; бифидобактерии - неподвижные грамположительные полиморфные палочки с бифуркацией на одном или двух концах, длиной (4-5) мкм, расположенные в виде скоплений или отдельных клеток.
Однородность дозированных единиц исследовали методом прямого определения по ГФУ по наличию в составе препарата заявленного количества раствора кислоты молочной. Ни одно из значений для анализируемых суппозиториев не вышло за пределы (75-115) %, приводимые ГФУ как предельно допустимые. Исследование количества микроорганизмов лакто- и бифидобактерий методом серийных разведений с последующим высевом на плотную среду показало, что наименьшее содержание клеток в препарате составлял 0,95-1010 клеток в одном суппозитории, что соответствует установленной для пробиотиков минимальной дозе.
Выводы. Разработаны методики идентификации суппозиториев с лакто- и бифидобактериями и кислотой молочной. Методика качественного определения основана: для кислоты молочной - на химической цветной реакции с раствором кислоты серной и раствором меди сульфата; для микроорганизмов - на изучении морфологии колоний, выросших на плотной питательной среде, и характера роста в жидкой, а также на основании исследования клеток под микроскопом. Количественное определение осуществляли: для кислоты молочной - методом обратной алкалиметрии, используя в качестве индикатора фенолфталеин, для микроорганизмов - методом разведения с последующим высеванием на плотные питательные среды. Полученные результаты свидетельствуют о том, что все показатели находятся в пределах нормы, ошибка метода не превышает значения, заявленного в нормативной документации.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Мальбахова Е. Т. Современный взгляд на проблему диагностики и лечения вульвовагинального кандидоза / Е. Т. Мальбахова, В. Г. Арзуманян // Вестник дерматологии и венерологиию - 2015. - №2. - С. 111-115.
2. Розробка складу і технологі супозиторів для профілактики та лікування вагінальних дисбіозів / О. С. Калюжная, Л. С. Стрельников, О. П. Стрілець, Г. І. Кабачний // Запорожский мед. журн. - 2009. - Т. 11, № 3. - С. 86-89.