Фитохимическое и фармакологическое изучение листьев persica vulgaris, заготовленных в Таджикистане

АННОТАЦИЯ

Проведено фармакогностическое и фармакологическое изучение листьев персика, заготовленных в Таджикистане. Определены основные диагностические признаки сырья. Установлено наличие органических и оксикоричных кислот, кумаринов, флавоноидов, дубильных веществ конденсированной природы и сапонинов. Определено количественное содержание (%) суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту - 4,74± 0,09; экстрактивных веществ; числовые показатели: зола общая - 10,85%, зола нерастворимая в НЯ - 1,10%. Влажность сырья составила - 6,67%. Количество частиц проходящих сквозь сито с диаметром 0,5мм колебалось от 0,37 до 0,68%. Определена иммунотропная активность экстракта персика в тестах in vitro.

Ключевые слова: персик, листья, морфологические и анатомические признаки, числовые показатели, фенольные соединения, иммунотропная активность

Актуальность. Персик обыкновенный Persica vulgaris Mill является ценной плодовой культурой широко распространенной во всем мире. Производство плодов этого растения год от года возрастает. В тройке лидеров стран производителей плодов персика на мировом рынке - Китай, США, Италия [15]. Плоды персика широко употребляются в пищу в свежем виде, а также консервируют. Семена являются источником персикового масла, применяемого в медицине и косметике. В народной медицине и диетологии плоды персика рекомендуется людям страдающими заболеваниями почек, при подагре, ревматизме, болезнях сердца, для улучшения работы желчного пузыря, печени, кишечника [6]. Интерес к этому растению, не только как к пищевому, но и как к источнику биологически активных веществ, применяемых в медицине и косметике, продолжает расти. Российскими учеными были разработаны комплексные антиоксидантные фитосредства, в состав которых входят экстракты листьев персика - «Персифен» и «Олексин», проявляющие противоопухолевое, иммуномодулирующее, адаптогенное действие [16, 17]. По данным литературы, экстракты персика обладают антиоксидантным, противоопухолевым (на моделях рака молочной железы и толстого кишечника) видами действия [11-14]. Республика Таджикистан имеет особые климатические условия, позволяющие с древних времен и до наших дней культивировать персик. Более распространенными здесь являются поздноцветущие и зимостойкие сорта, изучение биологически активных веществ которых, позволит обеспечить достаточную сырьевую базу для производства эффективных фитопрепаратов.

Целью нашей работы было изучение морфологических, анатомических диагностических признаков листьев персика заготовленных в Таджикистане, определение их числовых показателей и изучение иммунотропной активности экстракта персика в тестах in vitro.

Материалы и методы. Объектом нашего исследования были листья персика сорта «Сальвей», заготовленные в Таджикистане в августе 2014 года после сбора плодов.

Для определения числовых показателей нами был проведен анализ листьев персика как регламентируют Государственная фармакопея Украины и Государственная фармакопея СССР 11 издания [1, 2, 3]. Были определены внешние признаки листьев, приготовлены препараты листа с поверхности и определены важнейшие диагностические анатомические признаки сырья; установлены числовые показатели, такие как потеря в массе при высушивании, общая зола, зола нерастворимая в НС1, содержание экстрактивных веществ и измельченность.

Изучение морфологических признаков сырья проводили вначале невооруженным глазом, а затем рассматривали сырье под стереомикроскопом. Микроскопические признаки сырья устанавливали на основании изучения листьев под микроскопом Биолам, при увеличении в 160, 400 и 800 раз. Диагностические признаки фотографировали с помощью фотокамеры «Digital camera for microscope DCM 300» (USB 2,0), resolution 3M pixels. Для микроскопического изучения отбирали кусочки листьев, кипятили их в 3% растворе щелочи, тщательно промывали водой. Промытыекусочки помещали на предметное стекло в каплю хлоралгидрата и слегка нагревали для дополнительного просветления препарата.

Потерю в массе при высушивании определяли при 105°С высушивая до постоянной массы [1]. Золу общую и золу нерастворимую в НС1, определяли в навесках сырья по 3 г, прокаливая сырье в муфельной печи при слабом красном калении около 500°С до постоянной массы. Для определения золы нерастворимой в НЯ к остатку в тигле, полученному после сжигания сырья прибавляли 15мл 10% раствора кислоты хлористоводородной и нагревали 10 минут на водяной бане, промывали водой, высушивали, сжигали, прокаливали до постоянной массы [2]. Для определения измельчённости сырья нами проведен ситовой анализ. Пробу сырья помещали на сито с диаметром отверстий 0,5мм и просеивали, не допуская дополнительного измельчения. Просеивание измельчённых частей считали законченным, если количество сырья, прошедшего сквозь сито при дополнительном просеве в течение 1 минуты, составляло менее 1% сырья оставшегося на сите [3]. Поскольку по литературным данным и нашим предварительным фармакологическим исследованиям, листья персика являются перспективным сырьем для получения различных комплексов биологически активных веществ, нами были определена сумма экстрактивных веществ извлекаемых - водой, 30%, 50% и 70% спиртом этиловым и общее содержание фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту для последующей стандартизации сырья [1].

Наличие основных групп биологически активных веществ устанавливали с помощью общепринятых химических реакций и хроматографического анализа [1, 3-5]. Количественное

определение суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту проводили методом спектрофотометрии по следующей методике.

1,0 г измельченного сырья (точная навеска) помещали в коническую колбу емкостью 100 мл с притертой пробкой, добавляли 50 мл 70% этанола, закрывали пробкой и взвешивали (ошибка 0,01г). Потом колбу соединяли с обратным холодильником и нагревали на водяной бане при температуре 50-60° С в течение 2 часов. После этого охлажденную колбу закрывали пробкой, взвешивали, и добавляли этанол до первоначальной массы. Полученную вытяжку фильтровали через сухой бумажный фильтр в сухую колбу емкостью 50 мл. Отбирали пипеткой 10 мл фильтрата, переносили в мерную колбу на 50 мл (или проводили разведения в другом объеме, учитывая коэффициент разведения) и доводили 70% этанолом до метки.

Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре Hewlett Packerd 8453 при длине волны 270 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали 70% этанол.

Содержание суммы полифенольных соединений (Х) в сырье в пересчете на кислоту

галловую вычисляли в процентах по формуле:

g_A • m • Ё • 50 • 0,25 • 100

4 • m • 25 • 25 •

где А - оптическая плотность исследуемого раствора; А0 - оптическая плотность стандартного раствора (галловой кислоты); m - масса навески сырья (г); m0 - масса навески стандартного образца (г); К - коэффициент разведения.

Для приготовления стандартного образца ФСО галловой кислоты около 0,01г (точная навеска) галловой кислоты помещали в мерную колбу на 25 мл и доводили до метки 96% этанолом (раствор А). 0,25 мл раствора А помещали в мерную колбу на 25 мл и доводили до метки тем самым растворителем.

Для определения иммунотропной активности нами был получен 30% спиртовое извлечение из листьев персика, которое было упарено до густого экстракта. Влажность составила 10,93%.

Иммунотропную активность экстракта персика (ЭП) изучали в тестах in vitro.

Приготовление тест-образцов ЭП для фармакологических исследований. Для получения тест-образцов 20 мг густого экстракта персика растворяли в 10 мл (2 мг/мл - большая доза) или 50 мл (0,4 мг/мл - меньшая доза) раствора Хэнкса без индикаторов и стерилизовали пропусканием через фильтр Millipore. Тест-образцы хранили при t 40С в холодильнике не более 3-х суток.

Для определения влияния тест-образцов с ЭП на жизнеспособность иммунокомпетентных клеток в опытах in vitro использовали клетки глоточной миндалины детей, полученные после операции аденотомии. Клетки получали в соответствии с методическими рекомендациями (Мельников О.Ф., 1981), культивировали в питательной среде 199 с содержанием глутамина 290 мкг/мл и гентамицина 40 мкг/мл [7]. В пробе с трипановым синим рассчитывали относительное

число погибших клеток (выраженное в %) до начала инкубации (1 час при t 370С) и после инкубации.

Результаты и обсуждение.

Сырье представляло собой смесь цельных и частично измельченных листьев продолговатоланцетной формы вытянутых или слегка изогнутых сверху - зеленого цвета, с нижней стороны - немного светлее. Длина листовой пластинки 8-10см, ширина 1-1,5 см; край листа зубчатый, верхушка заостренная, основание клиновидное. На верхней стороне листовой пластинки, по жилке наблюдается небольшая бороздка. Листья - простые, черешковые, жилкование - перисто-краевое, запах - слабый специфический, вкус - слегка вяжущий. При рассмотрении листьев персика с поверхности видны многогранные толстостенные клетки эпидермиса, устьичный аппарат аномоцитного типа. Устьиц больше с нижней стороны листовой пластинки (рисунки 1,2). В мезофилле и по жилкам листа имеется много друз и призматических кристаллов оксалата кальция (рисунок 3). Черешок короткий, содержит несколько проводящих пучков. На зубцах листьев расположены водяные устьица - гидатоды (рисунок 4).

При анализе сырья показатель золы общей составил 10,85%, золы нерастворимой в HCl - 1,10%. Влажность сырья составила - 6,67%. Количество частиц проходящих сквозь сито с диаметром 0,5мм было определено в 5 образцах сырья и колебалось от 0,37 до 0,68%.

В результате определения экстрактивных веществ в листьях персика установлено, что при экстракции водой их содержание составляет 38,71%, 30% этиловым спиртом - 29,56%; 50% - 28,51%; 70% - 19,17%. Исходя из полученных данных, наиболее оптимальным в процентном отношении и дешевым экстрагентом является - вода. Также достаточно эффективным экстрагентом является 30 % спирт.

128

По результатам общепринятых качественных реакций, хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента нами были обнаружены органические кислоты, кумарины, флавоноиды, дубильные вещества конденсированной природы, гидроксикоричные кислоты, сапонины.

Содержание суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту определенное спектрофотометрически составило 4,74±0,09%. Метрологические характеристики среднего результата определения содержания фенольных соединений даны в таблице 1.

Таблица 1 - Метрологические характеристики среднего результата определения содержания фенольных соединений в листе персика

Наличие полифенольных соединений в сырье, водном и спиртовом экстрактах листьев персика позволяет предположить наличие у них иммуномодулирующей активности [9].

Поставлено 5 серий эксперимента. Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2 - Влияние различных доз густого экстракта персика на жизнеспособность

иммунокомпетентных клеток миндалин

Примечания: первая цифра обозначает относительное число клеток (%), окрашенных в синий цвет, до культивирования, вторая - после него.

Влияние тест-образцов с ЭП на содержание иммуноглобулина IgA.

Применяли метод радиальной иммунодиффузии в геле (Mancini E.A., 1965) [7]. Для этого 0,1 мл тест-образцов смешивали с 0,1 мл стандартной сыворотки человека, содержащей в 1 мл 2 г/л IgA, после чего инкубировали в стерильных условиях в течение 16-и часов. В первой контрольной пробе вместо тест-образцов с ЭП применяли эквивалентное количество раствора глюкозы, во второй контрольной пробе использовали - раствора Хэнкса. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Содержание иммуноглобулина IgA после инкубации с различными

концентрациями экстракта персика, г/мл

Влияние тест-образцов с ЭП на экспрессию поверхностных антигенов.

Экспрессию поверхностных антигенов по кластерам дифференциации (CD) исследовали после инкубации эритроцитов с экстракта персика в концентрации 0,4 мг/мл в течение 16-и часов в культуре in vitro c использованием метода розеток (Новиков Д., 2000) [10]. Метод основан на том, что формалинизированные эритроциты, покрытые соответствующими моноклональнами антителами, формируют розетку вокруг лимфоцита с определенным CD-фенотипом, которые легко подсчитываются в световом микроскопе. Показатель выражается в относительном количестве (в %) клеток данного фенотипа на 100 лимфоцитов. Использовали следующие маркеры: CD4 (Т- лимфоциты - хелперы), CD16 (NK - натуральные киллеры), CD25 (активированные лимфоциты), CD95 (клетки с маркером апоптоза). Данные эксперимента представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Содержание лимфоцитов определенного фенотипа (CD) после инкубации с

экстрактом персика в дозе 0,4 мг/мл

Примечания: К - контроль (относительное число клеток в исходной взвеси до инкубации).

Исследование влияния тест-образца с ЭП на активность тканевых естественных цитотоксических клеток (ЕЦК). Клетки миндалин получали по методу, описанному выше. Использовали спектрофотометрический метод регистрации цитолиза по выходу гемоглобина из эритроцитов цыплят (О.Ф. Мельников, Т.А. Заяц, 1999) [8]. Соотношение эффектор / мишень составляло 5:1, время инкубации - 16 часов. Средой для культивирования был выбран обогащенный бесцветный раствор Хэнкса (2% эмбриональная телячья сыворотка, производства компании Serva; концентрат незаменимых аминокислот, производства компании Sigma; гентамицин 40 мкг/мл). Исследования проводили с использованием иммуноферментного анализатора Stat Fax 2100 (США). В предварительных опытах большая концентрация экстракта персика угнетала активность ЕЦК, поэтому эксперимент проведен только с малой дозой экстракта персика (0,4 мг/мл). Результаты опыта представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Влияние экстракта персика на активность ЕЦК (% деструкции мишеней)

Выводы.

Изучены морфологические и анатомические диагностические признаки листьев персика выращенного в Таджикистане.

Установлено, что листья персика обыкновенного содержат различные классы биологически активных веществ, таких как: органические кислоты, кумарины, флавоноиды, дубильные вещества конденсированной природы, гидроксикоричные кислоты, сапонины.

Определены числовые показатели листьев персика, заготовленных в Таджикистане. Оптимальным экстрагентом является вода (38,71%), а также 30% этиловый спирт (29,56%). Содержание суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту составило 4,74±0,09%. Добавление экстракта персика в среду культивирования иммунокомпетентных лимфоидных клеток не оказывает цитотоксического действия в концентрациях 0,4 и 2 мг/мл.

Под влиянием экстракта персика существенным образом не изменяется экспрессия поверхностных антигенов лимфоцитов.

Экстракт персика обладает умеренно выраженным стимулирующим действием как в отношении факторов врожденного (усиление естественной цитотоксичности), так приобретенного иммунитета (усиление антителообразования) в тестах in vitro.

Иммуностимулирующая активность экстракта персика более выражена в низкой концентрации 0,4 мг/мл, чем в высокой - 2 мг/мл. Полученные данные будут использованы для стандартизации сырья и разработки новых фитопрепаратов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Государственная фармакопея СССР: Вып.1. Общие методы анализа/ МЗ СССР. - 11 изд.- М.: «Медицина», 1987. - 336с.
2. Державна Фармакопея Украіни / Державне підприемство “Науково-експертний фармакопейний центр”. - 1-е вид. - Доповнення 2. - Харків: РІРеГ, 2008. - 620 с.
3. Державна Фармакопея Украіни / Державне підприемство —Науково-експертний фармакопейний центр”. - 1-е вид. - Доповнення 1. - Харків: РІРЕГ, 2004. - 520 с.
4. Практикум по фармакогнозии: учеб. пособие для студ. вузов/ В.Н.Ковлев, Н.В.Попова, В.С.Кисличенко и др..; под. общ ред. В.Н.Ковлева. - Х.: Изд-во НФаУ: Золотые страницы, 2003. - 512с.
5. Стандартизація збору для лікування інфекційних захворювань легень і туберкульозу / Д.В.Упир, А.В.Мартинов, В.С.Кисличенко, Н.І.Ільінська // Вісник фармаціі. - 2013.- № 2 (74). - С. 38-40.
6. Фармацевтична енциклопедія / Голова ред. ради та автор передмови В.П. Черних. - 2-ге вид., переробл. І доповн. - К.: «МОРІОН» 2010. - 1632 с.: іл. 16 с.
7. Мельников О.Ф. Иммунологические аспекты генеза хронического тонзиллита и регуляции функциональной активности небных миндалин // Дисс. докт.мед.наук.: 14.00.16.- Киев. Институт физиологии АН УССР.-1981.-294 с.
8. Мельников О.Ф., Заяц Т.А. Сравнительное изучение радиоизотопного и спектрофотометрического метода исследования цитолиза клеток // Лаб. диагностика. -1999. - № 5. - С. 43-45.
9. Мельников О.Ф. Иммуномодуляция фитопрепаратами в терапии воспалительных заболеваний верхних дыхательних путей (экспериментальные и клинико-иммунологические исследования) : моногр. / Мельников О.Ф., Пелешенко Н.А., Заболотная Д.Д., Рыльская О.Г. - К., 2013. - 108 с.
10. Новиков Д.К., Новиков П.Д. Метод определения Т и В лимфоцитов диагностикумами на основе моноклональных антител // Иммунология.-2000.-№ 2.- С.31-33.
11. Identifying Peach and Plum Polyphenols with Chemopreventive Potential against Estrogen-Independent Breast Cancer Cells / G. Noratto, W. Porter, D. Byrne, L. Cisneros-Zevallos // Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009; 57 (12): 521-529
12. Large variation found in the phytochemical and antioxidant activity of peach and plum germplasm / Vizzotto M., Cisneros-Zevallos L., Byrne D. H., Ramming D. W., Okie, W. R. // J. Am. Soc. Hortic. Sci. 2007, 132 (3), 334-340.
13. Polyphenolics from peach (Prunus persica var. Rich Lady) inhibit tumor growth and metastasis of MDA- MB-435 breast cancer cells in vivo / G. Noratto, W. Porter, D. Byrne, L. Cisneros-Zevallos // The Journal of Nutritional Biochemistry, 2014, Volume 25, Issue 7, Pages 796-800,
14. Rossato S.B, Haas C. Raseira Mdo C., Moreira J.C, Zuanazzi J.A. Antioxidant potential of peels and fleshes of peaches from different cultivars / Rossato S.B, Haas C. Raseira Mdo C., Moreira J.C, Zuanazzi J.A. // J Med Food 2009;12(5):1119-1126
15. http://faostat.fao.org/ http://artlife-ukraine.net/persifen.html, http://www.oleksyn.com.ua/