Сравнительное исследование биологически активных соединений липофильных фракций cruciata glabra (l.) ehrend. и cruciata laevipes opiz

АННОТАЦИЯ

Впервые из травы круциаты голой (Cruciata glabra (L.) Ehrend.) и круциаты гладкой (Cruciata laevipes Opiz.) получены липофильные фракции биологически активных веществ. Методом ТСХ в субстанциях выявлены хлорофиллы, каротиноиды, кумарины и иридоиды. Методом абсорбционной спектрофотомерии в липофильных фракциях определено содержание хлорофиллов и каротиноидов; хромато-масс- спектрометрическим методом исследованы карбоновые кислоты - идентифицированы 39 кислот, которые представлены одно- и двухосновными насыщенными, ненасыщенными, ароматическими и гидроксикоричными кислотами, и установлено их содержание.

Ключевые слова: мареновые, спектрофотометрия, хромато-масс-спектрометрия, хлорофиллы, каротиноиды, карбоновые кислоты.

Круциата (Крестообразник) - Cruciata Mill. - небольшой род сем. Rubiacaea Juss., насчитывающий во флоре Украины 8, сопредельных государств - 17, в мировой флоре - 20 видов. Четыре вида являются эндемиками горного Крыма. Наибольший ареал имеют два вида - круциата голая (Cruciata glabra (L.) Ehrend.), произрастающая в горных, предгорных районах Западной Украины и на Полесье и круциата гладкая (Cruciata laevipes Opiz.) - растение произрастает на всей территории Украины, кроме степных районов [8-10,13].

В ранних работах по систематике род Круциата не выделялся, виды рода были отнесены к морфологически близкому роду Подмаренник (Galium L.) [8, 9]. В частности, Cruciata glabra (L.) Ehrend. рассматривалась как Galium vernum Scop. - подмаренник весенний, Cruciata laevipes Opiz. отождествлялась с Galium cruciata (L.) Scop. - подмаренником крестообразным. Согласно современной систематике семейства Мареновые род Круциата (Cruciata Mill.) является независимой таксономической единицей [1].

Наряду с соединениями фенольной и терпеноидной природы как хемотаксономические маркеры семейства Мареновые предложены жирные кислоты [12]. В связи с этим изучение карбоновых кислот родов семейства Мареновые является не только частью комплексного фитохимического исследования растительного сырья, но и может способствовать решению дискуссионных вопросов систематики.

Ранее нами были изучены компоненты эфирного масла травы круциаты голой и круциаты гладкой [5,6].

Целью настоящей работы явилось изучение биологически активных веществ (БАВ) липофильных фракций травы к. голой и к. гладкой флоры Украины.

Материалы и методы. Образцы сырья заготовлены на территории Украины в фазу полного цветения: трава к. голой заготовлена в мае 2012г. в г. Яремче Ивано- Франковской и Львовской областях; трава п к. гладкой - в июне 2012г. в Харьковской и Ивано-Франковской областях.

Тождественность заготовленного сырья подтвердилась сравнением с аутентичными образами гербарного фонда кафедры фармакогнозии Национального фармацевтического университета. Объектами исследования стали липофильные фракции, полученные из травы к. голой и к. гладкой методом исчерпывающей циркуляционной экстракции сырья хлороформом в аппарате Сокслета при соотношении сырье: экстрагент 1:10-1:12; время экстракции - 32-40 часов. После окончания процесса экстракции хлороформ отгоняли в вакуумном испарительном аппарате до исчезновения запаха экстрагента.

Идентификацию БАВ липофильных фракций проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системах растворителей гексан: ацетон (8:2); гексан: ацетон (6:4); этилацетат: уксусная кислота ледяная: вода (10:2:3); как хромогенные проявители использовались: раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты, реактивы Шталя и Трим- Хилла, 10%-ный спиртовой раствор калия гидроксида и раствор диазотированной сульфаниловой кислоты.

Таблица 1 - Содержание хлорофиллов и каротиноидов в липофильных фракциях травы круциат голой и круциаты гладкой (n=5; Р=0,95)

Содержание хлорофиллов и каротиноидов было установлено методом абсорбционной спектрофотомерии согласно уравнений Винтерманс и Де Мотс (с использованием коэффициентов перерасчета на хлорофиллы а и b) и уравнения Ванштейна (в пересчете на в-каротин) [7].

Карбоновые кислоты фракций изучены хромато-масс-спектрометрическим методом с использованием газового хроматографа Agilent Technologies 6890 с масс- спектрометрическим детектором 5973 согласно ранее описанной методике [2]. Идентификацию карбоновых кислот осуществляли путем сравнения масс-спектров полученных веществ с данными библиотек масс-спектров NIST05 и WILEY 2007 в сочетании с программами для идентификации AMDIS и NIST; содержание кислот рассчитывалось с использованием внутреннего стандарта.

Результаты и обсуждение. Выход липофильных фракций в пересчете на абсолютно сухое сырье для травы к. голой составил 6,84%, для травы к. гладкой - 4,08%.

Липофильная фракция травы к. голой - порошкообразная масса желто-зеленого цвета со специфическим запахом; липофильная фракция к. гладкой - вязкая масса темно-зеленого цвета со специфическим запахом. Фракции растворимы в гексане, ацетоне и хлороформе, при нагревании растворимы в 96%-ном спирте; нерастворимы в воде очищенной и водноспиртовых смесях.

Таблица 2 - Карбоновые кислоты липофильных фракций травы круциаты голой и круциаты гладкой

Продолжение табл. 2

Примечание: «-» - кислота не выявлена

Методом ТСХ по хроматографическим характеристикам в липофильной фракции травы к. голой идентифицированы хлорофиллы, каротиноиды и кумарины; в липофильной фракции травы к. гладкой - хлорофиллы, каротиноиды, кумарины и иридоиды. Согласно данным научных первоисточников, трава к. голой содержит иридоиды, однако нами этот класс соединений в этом объекте не выявлен [4]. Содержание хлорофиллов и каротиноидов в исследуемых фракциях приведено в таблице 1.

Как видно из таблицы в липофильной фракции травы к. голой содержание суммы хлорофиллов и каротиноидов превышает содержание в липофильной фракции травы к. гладкой в 2 и 3,3 раза, соответственно.

В исследуемых фракциях идентифицировано и установлено содержание 39 карбоновых кислот (табл. 2). Хроматограммы метиловых эфиров карбоновых кислот липофильной фракции травы к. голой и травы к. гладкой представлены на рис. 1 и 2.

В липофильной фракции травы к. голой идентифицировано и установлено содержание 33 карбоновых кислот. Сумма карбоновых кислот составила 58636,4мг/кг. В исследуемой фракции травы к. гладкой идентифицировано и установлено содержание 30 карбоновых кислот, сумма карбоновых кислот - 83603,4мг/кг.

Для липофильных фракций общими являются 24 карбоновые кислоты; оригинальными для липофильной фракции травы к. голой являются насыщенные кислоты - капроновая, гептановая, каприловая, нонановая, адипиновая и гексакозановая; ненасыщенные - 3-гексеновая, 11,14-эйкозадиеновая и 11,14,17-эйкозатриеновая кислоты. Специфичные кислоты липофильной фракции травы к. гладкой представлены ненасыщенной одноосновной 11,13-эйкозадиеновой кислотой, двухосновными

насыщенными кислотами - фумаровой, янтарной, глютаровой и 2-окси-3- метилглютаровой, гидроксикоричной кислотой - кислотой феруловой.

10

В липофильной фракции травы к. гладкой содержание ароматических кислот - бензойной, фенилуксусной и ванилиновой - существенно превышает содержание этих соединений в липофильной фракции травы к. голой - в 1,64; 2,44 и 1,76 раза,

соответственно.

Доминирующими карбоновыми кислотами липофильной фракций травы к. голой и к. гладкой являются (мг/кг) - пальмитиновая (20428,4 и 32933,5, соответственно), линоленовая (13071,1 и 17684,6, соответственно) и линолевая (10440,2 и 14493,9, соответственно).

Ранее нами установлена прямая зависимость между содержанием отдельных жирных кислот и противогрибковой активностью липофильных фракций, полученных из растений рода Подмаренник [3]. Учитывая химический профиль липофильных фракций травы к. голой и к. гладкой, актуальным является изучение антибактериальной и противогрибковой активности полученных субстанций.

Выводы

1. Впервые из травы круциаты голой и круциаты гладкой получены липофильные фракции биологически активных веществ.
2. Методом ТСХ в субстанциях выявлены хлорофиллы, каротиноиды, кумарины и иридоиды. Методом абсорбционной спектрофотомерии в липофильных фракциях определено содержание хлорофиллов и каротиноидов - для липофильной фракции травы круциаты голой сумма хлорофиллов и каротиноидов составила 8,57% и 0,49%, соответственно; для липофильной фракции травы круциаты гладкой - 4,38% и 0,15%, соответственно. Хромато-масс-спектрометрическим методом исследованы карбоновые кислоты - идентифицировано и установлено содержание 39 кислот, которые представлены одно- и двухосновными насыщенными кислотами, ненасыщенными кислотами, ароматическими кислотами и одной гидроксикоричной кислотой - кислотой феруловой. В липофильной фракции травы круциаты гладкой содержание ароматических кислот - бензойной, фенилуксусной и ванилиновой - в 1,64; 2,44 и 1,76 раза, соответственно, превышает концентрацию этих соединений в липофильной фракции травы круциаты голой.
3. Химический профиль липофильных фракций свидетельствует о целесообразности изучения антибактериальной и противогрибковой активности полученных субстанций.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Еленевский, А. Г. Таксономический обзор рода Cruciata Mill. (Rubiaceae). Genus Cruciata Mill. (Rubiaceae). Revisio taxonomico / А. Г. Еленевский, Н. Г. Куранова // Новости систематики высших растений. 2000. Т.32. С. 152-162.
2. Дослідження складу хлороформноі фракціі трави підмаренника несправжньом’якого / О. Ю. Лещенко, О. В. Горяча, Т. В. Ільіна, А. М. Ковальова // Запорожский мед. журн. 2012. № 3 (72). С. 92-95.
3. Протигрибкова активність ліпофільних фракцій рослин роду Galium. Повідомлення 1. / Н. В. Кашпур, Горяча О.В., Ільіна Т.В., Ковальова А.М., Волянський А.Ю., Осолодченко Т.П. // Клінічна фармація. 2012.
4. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Caprifoliaceae - Plantaginaceae / отв. ред. П. Д. Соколов. Л. : Наука, 1990. 328 с.
5. Терпеноиды и ароматические соединения эфирных масел травы Cruciata laevipes Opiz. и Cruciata glabra (L.) Ehrend. / Т.В. Ильина, А. М. Ковалева, О. В. Горячая, Б. А. Виноградов // Химия природных соединений. 2012. № 6. С. 976-977.
6. Терпеноиды эфирного масла Cruciata laevipes Opiz / Н. С. Юрченко, О. В. Горячая, Т. В. Ильина, А. М. Ковалева // «Вопросы современной медицины» (Часть II): материалы Международной заочной научно-практической конференции (Новосибирск, 28 ноября 2011г.) : тез. докл. - Новосибирск: Изд. «Сибирская ассоциация консультантов», 2011. С. 82-86.
7. Туманов В. Н. Качественные и количественные методы исследования пигментов фотосинтеза / В. Н. Туманов, С. Л. Чирук. Гродно: Гр ГУ им. Я. Купалы, 2007. 62 с.
8. Флора СССР / ред. В. К. Шишкин. М. : Изд-во: АН СССР, 1958. Т. 23. 776 с.
9. Флора УССР / ред. М. І. Котов. К.: Вид-во: АН УРСР, 1961. Т.10. 491 с.
10. Черепанов С. К. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР) / С. К. Черепанов. - Спб. : Мир и семья, 1995. 992с.
11. Iridoid patterns in Galium L. and some рhylogenetic considerations / Maya Iv. Mitova, Mincho E. Anchev, Nedjalka V. Handjieva et al. // Zeitschrift fur Naturforschung C. 2002. Vol. 57, № 3-4. Р. 226-234.
12. Mongrand, S. Chemotaxonomy of the Rubiaceae family based on leaf fatty acid composition / Mongrand S., Badoc A., Patouille B., Lacomblez C. and others // Phytochemistry. 2005. 66(5). P. 549-59.
13. Mosyakin S. L. Vascular plants of Ukraine: a nomenclatural checklist / S. L. Mosyakin, M. M. Fedoronchuk // National Academy of Sciences of Ukraine / M. G. Kholodny Institute of Botany. К., 1999. 345 p.