Другие статьи

Цель нашей работы - изучение аминокислотного и минерального состава травы чертополоха поникшего
2010

Слово «этика» произошло от греческого «ethos», что в переводе означает обычай, нрав. Нравы и обычаи наших предков и составляли их нравственность, общепринятые нормы поведения.
2010

Артериальная гипертензия (АГ) является важнейшей медико-социальной проблемой. У 30% взрослого населения развитых стран мира определяется повышенный уровень артериального давления (АД) и у 12-15 % - наблюдается стойкая артериальная гипертензия
2010

Целью нашего исследования явилось определение эффективности применения препарата «Гинолакт» для лечения ВД у беременных.
2010

Целью нашего исследования явилось изучение эффективности и безопасности препарата лазолван 30мг у амбулаторных больных с ХОБЛ.
2010

Деформирующий остеоартроз (ДОА) в настоящее время является наиболее распространенным дегенеративно-дистрофическим заболеванием суставов, которым страдают не менее 20% населения земного шара.
2010

Целью работы явилась оценка анальгетической эффективности препарата Кетанов (кеторолак трометамин), у хирургических больных в послеоперационном периоде и возможности уменьшения использования наркотических анальгетиков.
2010

Для более объективного подтверждения мембранно-стабилизирующего влияния карбамезапина и ламиктала нами оценивались перекисная и механическая стойкости эритроцитов у больных эпилепсией
2010

Нами было проведено клинико-нейропсихологическое обследование 250 больных с ХИСФ (работающих в фосфорном производстве Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции)
2010


C использованием разработанных алгоритмов и моделей был произведен анализ ситуации в системе здравоохранения биогеохимической провинции. Рассчитаны интегрированные показатели здоровья
2010

Специфические особенности Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции связаны с производством фосфорных минеральных удобрений.
2010

Активация синтеза арглабина в суспензионной культуре полыни гладкой

Применение в качестве сырья для получения биологически активных соединений культуры кле­ток и тканей приобретает в последнее время особую актуальность. Изыскание путей компенсации дефицита некоторых видов лекарственных растений привело к использованию принципиально ново­го метода получения отдельных биологически активных соединений растительного происхождения, в котором в качестве сырья используются изолированные ткани и клетки, растущие на искусственных питательных средах. Интерес к этому методу непрерывно растет, так как в настоящее время доказано, что, помимо способности растительных клеток синтезировать биологически активные вещества са­мого различного типа действия (антивирусного, противоопухолевого, антибиотического), клетки культуры тканей могут быть использованы для биотрансформации ряда соединений как источник для получения протеолитических ферментов [1].

Благодаря методам биотехнологии появляется возможность получать биомассу ценных проду­центов биологически активных веществ независимо от климатических условий и времени года. Наи­более целесообразно использование глубинной технологии выращивания клеток высших растений, так как это позволяет использовать стандартное микробиологическое оборудование. Большой инте­рес для медицины представляют биологически активные терпеноиды, в частности, сесквитерпеновые лактоны. На базе Института фитохимии разработан и введен в клиническую практику противоопухо­левый препарат «Арглабин», основу которого составляет одноименный сесквитерпеновый лактон.

Практическому использованию культуры клеток растений в качестве исходного сырья препятст­вует одно очень важное обстоятельство. Как показывают проведенные экспериментальные работы, в культурах клеток, как правило, резко снижается способность к синтезу вторичных метаболитов [2]. Это объясняется прежде всего тем, что в таких культурах частично теряется способность к реализа­ции генетической информации, относящейся ко вторичному обмену. Скорее всего, это связано с по­терей организменного контроля и переходом к популяционным механизмам регуляции метаболизма клеток. В основе физиологического регулирования процессов вторичного синтеза лежит изучение влияния таких факторов культивирования на рост и метаболизм клеток, как регуляторы роста, мине­ральные вещества, витамины, сахара, свет, аэрация, температура.

Можно предположить, что чем ближе клетка или группа клеток по уровню организации к цело­му растению, тем более вероятно, что в них будут реализовываться метаболические пути, характер­ные для целого организма. Вторичный метаболизм — это особенность дифференцированных расти­тельных клеток и тканей. Он присущ только специализированным органам и только определенным фазам развития растений [3]. Имеющиеся в литературе данные о положительной корреляции между накоплением вторичных метаболитов и степенью дифференцировки в культурах клеток подтвержда­ют этот факт [4]. Исследования китайских ученых показали, что выход артемизинина при культиви­ровании полыни однолетней в биореакторах увеличивается, когда создаются условия для появления регенерантов в клеточной суспензии [5]. Выявлена также взаимосвязь между морфогенезом и образо­ванием эфирных масел в культурах тканей полыни лимонной [6] и гладкой [7].

 

Учитывая все эти факторы, важно было рассмотреть возможность увеличения синтеза целевого вещества в суспензионной культуре полыни гладкой за счет получения агрегированной морфогенной культуры.

Материал и методы исследования

Объектом исследования является суспензионная культура полыни гладкой (Artemisia glabella Kar. et Kir.) — эндемичного растения Центрального Казахстана.

Пересадку культивируемых объектов осуществляли в ламинарном боксе ЛБ-Г с продувкой сте­рильным воздухом. Культивирование суспензий клеток проводили в аппарате культивирования УВМТ-12-250, в конических колбах на 250 мл.

Культивационные среды и посуда стерилизовались в автоклаве при 1,2 атмосферы в течение 20 мин. Скорость роста оценивали по значению ростового индекса (РИ), вычисляемого по формуле

В экспериментах по культивированию тканей использовали общие методические приемы, опи­санные в монографиях Р.Г.Бутенко [8], Ф.Л.Калинина и других [9].

Основными факторами, влияющими на дедифференциацию эксплантов и морфогенетические процессы в культуре клеток, являются ауксины и цитокинины. В качестве ауксинов использовали 3-индолилуксусную кислоту (ИУК), нафтилуксусную кислоту (НУК), 2,4 -дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4 -Д); в качестве цитокининов — 6-бензиламинопурин (БАП) и кинетин.

Культивирование суспензионной культуры клеток проводили в жидкой питательной среде, а растений-регенерантов — на агаризованной среде Мурасиге — Скуга [10].

Содержание арглабина в образцах биомассы суспензионной культуры полыни гладкой опреде­ляли методом ВЭЖХ на приборе HEWLETT PACKARD Agilent 1100 Series.

Результаты и обсуждение

Для получения крупных морфогенных агрегатов в суспензионной культуре мы изучали влияние различных сочетаний цитокининов (БАП, кинетин) и ауксинов (ИУК, НУК, 2,4-Д) в концентрациях 2мг/л, так как более низкие концентрации приводят к подавлению эмбриоидогенеза. Анализировали морфологические характеристики и степень агрегированности ткани в суспензионной культуре.

Среди цитокининов наиболее эмбриогенообразующим является БАП. Кинетин в исследуемых дозах не приводил к морфогенезу и формированию эмбриоидов.

Среди ауксинов наименее морфогенным оказался 2,4-Д. Суспензионная культура на среде с 2,4-Д становилась гомогенной, теряла зеленую окраску, вплоть до полного обесцвечивания, степень аг-регированности низкая, агрегаты однородные, рыхлые, мелкие, без органоподобных структур.

Использование нафтилуксусной кислоты в сочетание с кинетином также способствовало потере окраски и низкой степени морфогенеза, формирования эмбриоидов или не наблюдали совсем, или формировались очень мелкие эмбриоиды на поверхности плотных агрегатов, которые не созревали и не переходили в стадию органогенеза. В сочетании с БАП использование НУК способствовало появ­лению у культуры яркой зеленой окраски, что свидетельствует об увеличении фотосинтетической активности культуры, но, однако, эмбриоиды не были получены.

Таким образом, нами выяснено, что для морфогенеза и эмбриоидогенеза необходимо присутст­вие в культивационной среде фитогормонов БАП и ИУК. Агрегаты, полученные в среде с таким со­держанием фитогормонов, обладали наилучшим морфогенетическим потенциалом, ткань имела яр­кую зеленую окраску, выраженное эмбриогенное строение. Экстраполируя данные по влиянию фито-гормонов на морфогенез и синтез арглабина в каллусной культуре полыни гладкой [11], можно пред­положить, что данное сочетание фитогормонов приведет к увеличению синтеза целевого вещества по сравнению с клеточной суспензией.

Для подтверждения формирования эмбриоидов в суспензионной культуре полыни гладкой нами было проведено гистологическое исследование процессов, происходящих в толще агрегатов. Для это­го участки эмбриогенеза были зафиксированы для гистологического изучения. Было обнаружено формирование меристематических очагов в агрегатах суспензионной культуры полыни гладкой. Это участки активно делящихся, поэтому более мелких клеток, тесно связанных между собой, без меж­клеточного пространства. В толще меристематических очагов такого рода расположено множество сосудистых элементов (рис. 1). Постепенно происходит формирование эмбриоидов, которые на гло­булярной стадии могут иногда распадаться на деградирующие и компетентные к эмбриогенезу клет­ки. Этот процесс, возможно, объясняет механизм длительного поддержания эмбриогенного потен­циала и тотипотентности в культуре клеток полыни гладкой. Следующим этапом дифференциации является формирование биполярных зародышей, с хорошо заметными, сформированными зонами апексов корней и стебля.

Гистологическое изучение агрегатов

Процесс формирования соматических эмбриоидов происходит спонтанно и асинхронно. Гисто­логические исследования показали, что на любой фазе цикла культивирования можно обнаружить эмбриоиды на различных стадиях развития.

Следует отметить, что агрегаты суспензионной полыни гладкой можно условно разделить на два типа — рыхлые и плотные, которые отличаются между собой некоторыми морфологическими харак­теристиками и способом формирования эмбриоидов. В рыхлых агрегатах формирование глобулярных эмбриоидов происходит во всей толще ткани, тогда как в плотных агрегатах глобулы расположены преимущественно на поверхности. Кроме того, эмбриоиды, формирующиеся из агрегатов различного типа, отличались регенеративной способностью. Приживаемость регенерантов, полученных из рых­лых агрегатов, была ниже, чем у регенерантов из агрегатов плотных.

Исследователями эмбриогенеза в культуре клеток растений [12, 13] отмечено, что деградирую­щие клетки, образующиеся параллельно с формированием эмбриоидов, характеризуются признаками, которые свойственны большинству секреторных клеток растений. Это увеличение объема клеток, часто извилистая форма, утолщение клеточных стенок и наличие периплазматического пространства (плазмолиз). Возможно, что именно наличие секреторных элементов приводит к увеличению продук­тивности вторичных метаболитов в эмбриогенных тканях полыни гладкой по сравнению с культура­ми, не обладающими морфогенным потенциалом.

Таким образом, с помощью гистологического изучения суспензионной культуры полыни глад­кой подтверждено наличие морфогенеза и формирование эмбриоидов при использовании фитогор-монов БАП и ИУК в концентрациях 2 мг/л.

Для подтверждения сохранности тотипотентности в суспензионной культуре полыни гладкой были получены растения — регенеранты из эмбриогенных тканей полыни гладкой (рис. 2).

Агрегаты, представляющие собой зрелые эмбриоиды на поздней стадии, из суспензионной куль­туры высаживали на среду МС без фитогормонов, с половинным содержанием сахарозы (1,5 %). Че­рез 5 суток наблюдали формирование первых листьев, подобных семядольным, без характерных для настоящих листьев рассечений. Через 20 суток сформировавшееся растение высаживали в почвенную смесь. Культивирование растений осуществляли при температуре 20оС и искусственном освещении.

Изучение динамики роста двух типов суспензионных культур показало (рис. 3), что степень росто­вой активности агрегированной культуры выше в три раза, чем клеточной (11 и 4,6 соответственно).

При сопоставлении динамики накопления арглабина с кривыми роста суспензионных культур обоих типов видно, что в течение лаг-фазы содержание арглабина в биомассе практически не изменя­ется. В фазу логарифмического роста, т. е. при интенсивном делении клеток уровень арглабина в культуре клеток полыни гладкой падает до минимальных значений. Увеличение содержания целевого вещества в биомассе наблюдается на фазе стационарного роста, т.е. при замедлении ростовой актив­ности и снижении уровня делящихся клеток [14].

Регенерация растений полыни гладкой


Сравнение уровня синтеза арглабина у двух типов суспензионных культур показывает несо­мненное преимущество агрегированной суспензии перед клеточной (рис. 4). Количество арглабина в биомассе, выращенной в агрегированной культуре, в 4 раза больше, чем при клеточном типе суспен­зии. Этот факт подтверждают литературные данные о том, что для синтеза вторичных метаболитов необходимы дифференцированные ткани.

Таким образом, был выбран перспективный тип культивируемой суспензии, а именно агрегатная суспензионная культура полыни гладкой, в которой сохраняются морфогенетический потенциал и способность к синтезу целевого вещества на уровне, сравнимом с каллусной тканью.

Сравнение динамики ростовой активности клеточной и агрегированной суспензионной культуры полыни гладкой

Сравнение накопления арглабина в суспензионных культурах клеточного и агрегированного типа

Выводы

  1. Оптимизирован состав фитогормонов для эмбриогенеза: ИУК — 2мг/л, БАП — 2мг/л. Гистоло­гическими исследованиями доказано формирование эмбриоидов в агрегатах суспензионной культуры.
  2. Исследована взаимосвязь между дифференциацией и уровнем синтеза арглабина. Количество арглабина в биомассе полыни гладкой увеличилось в 4 раза по сравнению с недифференцированной культурой и достигло 0,38 % от сухого веса.

 

 

Список литературы

1      Чиков П.С. Растения — один из важнейших источников лекарственных средств // Химико-фармацевтический журнал. — 1986. — № 1. — С. 97-104.

2      Пасешниченко В.А. Растения — продуценты биологически активных веществ // Соросовский образовательный жур­нал. — 2001. — Т. 7. — № 8. — С. 171-182.

3      Лукнер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных. — М.: Мир, 1979.

4      Загоскина Н.В. Метаболизм фенольных соединений в связи с дифференциацией растительной клетки в условиях in vitro // Физиология растений — наука III тысячелетия: Тез. докл. междунар. конф. — М., 1999. — С. 581-582.

5      Liu C.Z., Wang Y.C., Guo C., OuyangF., Ye H.C., Li G.F. Production artemisinin by shoot cultures of Artemisia annua L.In a modified inner-loop mist bio reactor // Plant Sci. — 1998. — № 2. — P. 211-217.

6      Барвина Т.В., Воробьёв А.С., Константинова Т.Н., Сергеева Л.И., Зальцман О.О. Морфогенез и образование эфир­ных масел у полыни лимонной // Молекул. генет. микробиол. и вирусол. — 1994. — № 4. — С. 18.

7      Amanov S.B., Andreeva A.P. Phytohormones ratio for Artemisia glabella in vitro cultivation.// В сб. «Medicinal raw material and phytopreparations for medicine and agriculture». — Karaganda, 1999. — P. 190.

8      Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. — М.: Наука, 1964. — 250 с.

9      Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Метод культуры изолированных тканей в физиологии и биохимии рас­тений. — Киев: Наука, 1980. — 488 с.

10   Murashige I., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiology Plant. — 1962. — № 15. — Р. 473-497.

11   Аманов С.Б. Изучение роста, морфогенеза культуры клеток полыни гладкой и синтеза в ней биологически активного сесквитерпеноида арглабина: Автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.23. — Кольцово, ГНЦ ВБ «Вектор», 2001. — 28 с.

12   Денебаева М.Г. Цитофизиологические особенности длительно культивируемых эмбриогенных каллусных тканей яч­меня: Автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.12. — Алматы: Ин-т физиологии, генетики и биоинженерии растений, 2003. — 30 с.

13   Амирова А.К. Соматический эмбриогенез и регенерация растений в длительно культивируемых каллусных тканях пшеницы: Автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.12. — Алматы: Ин-т физиологии, генетики и биоинженерии растений,2004. — 30 с.

14   Додонова А.Ш., Аманов С.Б., Адекенов С.М. Суспензионная культура полыни гладкой — источник сесквитерпенового лактона арглабина // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Третий междунар. конгресс — М., 2005. — С. 80.

Разделы знаний

Архитектура

Научные статьи по Архитектуре

Биология

Научные статьи по биологии 

Военное дело

Научные статьи по военному делу

Востоковедение

Научные статьи по востоковедению

География

Научные статьи по географии

Журналистика

Научные статьи по журналистике

Инженерное дело

Научные статьи по инженерному делу

Информатика

Научные статьи по информатике

История

Научные статьи по истории, историографии, источниковедению, международным отношениям и пр.

Культурология

Научные статьи по культурологии

Литература

Литература. Литературоведение. Анализ произведений русской, казахской и зарубежной литературы. В данном разделе вы можете найти анализ рассказов Мухтара Ауэзова, описание творческой деятельности Уильяма Шекспира, анализ взглядов исследователей детского фольклора.  

Математика

Научные статьи о математике

Медицина

Научные статьи о медицине Казахстана

Международные отношения

Научные статьи посвященные международным отношениям

Педагогика

Научные статьи по педагогике, воспитанию, образованию

Политика

Научные статьи посвященные политике

Политология

Научные статьи по дисциплине Политология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Психология

В разделе "Психология" вы найдете публикации, статьи и доклады по научной и практической психологии, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. В своих работах авторы делают обзоры теорий различных психологических направлений и школ, описывают результаты исследований, приводят примеры методик и техник диагностики, а также дают свои рекомендации в различных вопросах психологии человека. Этот раздел подойдет для тех, кто интересуется последними исследованиями в области научной психологии. Здесь вы найдете материалы по психологии личности, психологии разивития, социальной и возрастной психологии и другим отраслям психологии.  

Религиоведение

Научные статьи по дисциплине Религиоведение опубликованные в Казахстанских научных журналах

Сельское хозяйство

Научные статьи по дисциплине Сельское хозяйство опубликованные в Казахстанских научных журналах

Социология

Научные статьи по дисциплине Социология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Технические науки

Научные статьи по техническим наукам опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физика

Научные статьи по дисциплине Физика опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физическая культура

Научные статьи по дисциплине Физическая культура опубликованные в Казахстанских научных журналах

Филология

Научные статьи по дисциплине Филология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Философия

Научные статьи по дисциплине Философия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Химия

Научные статьи по дисциплине Химия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Экология

Данный раздел посвящен экологии человека. Здесь вы найдете статьи и доклады об экологических проблемах в Казахстане, охране природы и защите окружающей среды, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. Авторы рассматривают такие вопросы экологии, как последствия испытаний на Чернобыльском и Семипалатинском полигонах, "зеленая экономика", экологическая безопасность продуктов питания, питьевая вода и природные ресурсы Казахстана. Раздел будет полезен тем, кто интересуется современным состоянием экологии Казахстана, а также последними разработками ученых в данном направлении науки.  

Экономика

Научные статьи по экономике, менеджменту, маркетингу, бухгалтерскому учету, аудиту, оценке недвижимости и пр.

Этнология

Научные статьи по Этнологии опубликованные в Казахстане

Юриспруденция

Раздел посвящен государству и праву, юридической науке, современным проблемам международного права, обзору действующих законов Республики Казахстан Здесь опубликованы статьи из научных журналов и сборников по следующим темам: международное право, государственное право, уголовное право, гражданское право, а также основные тенденции развития национальной правовой системы.