8-бром-3-метилксантин субстанциясының сапасын бақылауға арналған сұйықтық хоматография әдістемесін жасау

Түйін

Алғаш рет жаңа биологиялық белсенді пурин туындысын идентификациялауға, тазалығын талдауға және сандық мөлшерін анықтауға арналған жоғары эффективті сұйықтық хроматография әдістемесі жасалынды. Құрамына мұзды сірке қышқылы қосылған метанол-су (35:65) жылжымалы фазасы әдістің селективтілігін қамтамасыз етті, 8-бром-3-метилксантин субстанциясының хроматографиялық шыңының ұсталу уақыты t1 6,42±0,02, ал тектес қоспа 3-метилксантиндікі t1 9,34±0,02 минут аралығында жатыр. Орташа нәтиженің салыстырмалы қателігі ± 0,44%, бұл әдістің қайталанғыштығы жоғары екендігін дәлелдейді. Жасалынған әдістеме 8-бром-3-метилксантин субстанциясының өзі екендігі, тазалығы және сандық анықтау көрсеткіштері бойынша нормативті құжат жобасына ұсынылды.

Кілт сөздер: жоғары эффективті сұйықтық хроматография, 8-бром-3-метилксантин, субстанция, валидация.

Медицина тәжірибесіндегі жүрек-қан тамырлары жүйесінің және бүйрек-несеп жолдарының ауру- ларында, бауыр патологиясы кезінде науқас ағзасында су ұсталып, түрлі ісінулер пайда болады. Сондықтан, несеп айдайтын заттарды (диуретиктер) артериялық қысымды төмендету үшін, сонымен қатар, жекелеген пре- параттарды химиялық заттармен уланғанда олардың ағзадан элиминациясын жылдамдату үшін қолданады [1].

Осыған байланысты медициналық ғылымдардың басты міндеттерінің бірі жоғары эффективті және адам ағзасына уыттылығы төмен жаңа биологиялық белсенді қосылыстарды іздеу болып табылады. Солардың ішінде жаңа пурин туындылары ксантиндер ерекше орын алады [2]. Көптеген зерттеулер нәтижесінде ксантин молеуласының айқын диуретикалық қасиеттері бар екендігі зерттелген [3-8].

Жаңа биологиялық белсенді қосылыстарды медицина тәжірибесіне енгізу үшін физика-химиялық қасиеттерін зерттеп, сапалық көрсеткіштерін стандарттап, уақытша аналитиакалық нормативтік құжат (УАНҚ) жобасын жасау қажет. Аналитикалық нормативтік құжаттарда дәрілік заттардың сандық мөлшерін анықтау үшін көбіне хроматографиялық, спектрофотометриялық әдістерді ұсынады. Себебі, бұл әдістердің спецификалығы, сезімталдығы, дәлдігі, дұрыстығы, қайталанғыштығы жоғары [9].

8-Бром-3-метилксантиннің хроматографиялық қасиеттерін зерттеу, осы субстанцияның сандық талдауы үшін айтарлықтай сенімді сұйықтық хроматография әдісін қолдануға мүмкіндік берді.

Зерттеудің мақсаты. 8-Бром-3-метилксантин субстанциясының сандық мөлшерін анықтауға арналған қайталанғыштығы және сезімталдығы жоғары эффективті сұйықтық хроматография әдістемесін жасау.

Зерттеудің әдістері мен материалдары. Жұмыста 8-бром-3-метилксантин (8-Br-3-MEX, CAS нөмірі 93703-24-3, РФ) және 3-метилксантин (3-MЕX; CAS нөмірі 1076-22-8, РФ) субстанциялары; «х.т.» және «т.д.т.» категориялы еріткіштер мен реактивтер, зертханалық электронды аналитикалық таразы («OHAUS Pioneer», 11

Швейцария), милливольтметр рН-150МА потенциометрі (НПО «Измерительная техника», Ресей Федерациясы), сандық мөлшерін анықтау үшін «Sykam» (Германия) фирмасының сұйықтық хроматографы қолданылды.

Хроматографиялық зерттеудің шарттары: S 7131 дегазаторы, S 2100 сорғысы (насос), S 5200 автосамплері, Reprospher C18-DE бағанасы (250×4,6 мм, 5 мкм), S 4011 термостаты: бағана температурасы 25ºC, S 3210 УК-детекторы: 280 нм толқын ұзындығында. Жылжымалы фазаның құрамына ионсыздандырылған су, метанол, мұзды сірке қышқылы кіреді. Зерттеу тәжірибесі 65:35 қатынастағы ионсыздандырылған су және мұзды сірке қышқылы (0,1% көлемде), сонымен қатар метанол және мұзды сірке қышқылынан (0,1% көлемде) тұратын градиентті элюирлеу арқылы жүргізілді. Жылжымалы фазаның жылдамдығы 1мл/мин, енгізілетін сынаманың көлемі – 5 мкл.

Статистикалық өңдеулер Statistica-Version 10 («StatSoft» компаниясы, АҚШ) бағдарламасы бойынша жасалынды.Зерттелетін 8-бром-3-метилксантин субстанциясы төменгі полярлы қосылыс болғандықтан, зерттеуде кері фазалы бағана қолданылды. Бағанадағы бөліну шарттарын таңдау жылжымалы фазаның оңтайлы құрамын және элюирлеу жылдамдығын анықтауды қамтиды.

Жүйенің оңтайлы құрамын таңдау барысында градиентті элюирлеу үшін концентрациясы 65:35 қатынасынан тұратын ионсыздандырылған су және мұзды сірке қышқылы (0,1%), сонымен қатар метанол және мұзды сірке қышқылы (0,1%) еріткіштері таңдап алынды. Осы жылжымалы фазада зерттелетін заттың хроматографиялық шыңының симметриялық пішінін алуға қол жеткізілді.

Анықтау әдістемесі. 50 мг (дәл өлшем) 8-бром-3-метилксантин субстанциясын сыйымдылығы 50 мл өлшеуіш колбаға салып, 5 мл концентрлі аммоний гидроксиді ерітіндісінде ерітіп, үстіне рН бейтарап мәнге (6,5-7,0) жеткенге дейін мұзды сірке қышқылын мұқият қосып араластырады, кейін белгісіне дейін этанолды мұқият қоса отырып жеткізіп, шайқап араластырады (А ерітіндісі).

Сыйымдылығы 100 мл өлшеуіш колбаға А ерітіндісінен 4 мл алып, белгісіне дейін этанолмен мұқият қоса отырып жеткізеді, шайқап араластырады (Б ерітіндісі, 250 нг/мл).

5 мкл-ден сыналатын Б ерітіндісі, 8-бром-3-метилксантин ЖСҮ ерітіндісін кезекпен 5-тен кем емес хроматограмма ала отырып, жоғарыда көрсетілген жағдайларда хроматографирлейді. Алынған хроматограммалар шыңдарының аудандарының стандартты салыстырмалы ауытқуы 2,0%-дан аспауы тиіс.

Әдістеменің сенімділігін дәлелдеу үшін ҚР МФ «Аналитикалық әдістемелер мен сынауларды валидациялау» монографиясына сәйкес келесі критерийлер бойынша валидациялау жүргізілді: спецификалығы, сызықтығы, дәлдігі, дұрыстығы және қайталанғыштығы.

Әдістеменің спецификалығын дәлелдеу үшін сандық анықтауға арналған 8-бром-3-метилксантиннен және оған 1%-дық мөлшері бойынша 3-метилксантинді қосып дайындалған 8-Br-3-MEX модельді ерітіндісін хроматографиялады.

8-Br-3-MEX субстанциясы модельді ерітіндісінің алынған шыңдарында 3-метилксантин тектес қоспасының және ерітікіштің жүйелік шыңдарымен айқын бөлінгені байқалды. Ерітіндінің хроматограммасында 8-бром-3-метилксантин-нің және тектес қоспа 3-метилксантиннің шыңдарының t1 және t2 ұсталу уақыттары куәгерлердің: 8-бром-3-метилксантин және 3-метилксантин (1, 2 және 3-ші суреттер) шыңдарының ұсталу уақыттарымен сәйкес келді: t1 6,42±0,2, t2 9,34±0,4.

12

Зерттеудің нәтижелері және оларды талқылау. Әдістеменің сызықтығы аналитикалық әдістемені қолдану аймағында бағаланды. Көрсетілген үлгідегі 50-350 нг/мл концентрациясы аралығына сай келетін 8- бром-3-метилксантин ерітінділерін жоғарыда көрсетілген жағдайда хроматографирлейді. Хроматографиялық көлемнің өзара байланысын көрсететін у=bx+a теңдеуі бойынша бағаланды. Сызықтық байланысты статистикалық өңдеу кезінде 8-бром-3-метилксантиннің сызықты регрессиялық графигінің корреляция коэффициенті r 0,9997 құрады. Алынған нәтижелер бойынша сызықтық байланыстың сақталғаны байқалды (кесте 1, сурет 4).

Кесте 1 – 8-Бром-3-метилксантиннің концентрациясы мен хроматографиялық шыңдар көлемі арасындағы сызықтық байланысты бағалау

Зерттелетін зат С, нг/мл

Хроматографиялық шыңның ауданы

Метрологиялық сипаттамалар (ҚР МФ, 1.т, 100.б)

50

3048,32

n = 7;

SD = 6,052 ± 0,007 RSD = 1,832 εорт, % = 1,78 r 0,9997

100

6229,49

150

8974,64

200

11932,09

250

15005,25

300

17994,16

350

20864,81

13

8-Бром-3-метилксантин ерітіндісінің ЖСҮ дайындау. 50 мг (дәл өлшем) 8-бром-3-метилксантин субстанциясын сыйымдылығы 50 мл өлшеуіш колбаға салып, 5 мл концентрлі аммоний гидроксиді ерітіндісінде ерітіп, үстіне рН бейтарап мәнге (6,5-7,0) жеткенге дейін мұзды сірке қышқылын мұқият қосып араластырады, кейін белгісіне дейін этанолды мұқият қоса отырып жеткізіп, шайқап араластырады (А ерітіндісі). Сыйымдылығы 100 мл өлшеуіш колбаға А ерітіндісінен 5 мл алып, белгісіне дейін этанолмен мұқият қоса отырып жеткізеді, шайқап араластырады (Б ерітіндісі). Ерітінді жаңа дайындалған күйінде қолданылады.

8-Бром-3-метилксантин субстанциясын ЖЭСХ әдісімен хроматографиялық зерттеу барысында анықталу шегі анықталды, ол зерттеу нысаны үшін 50 нг/мл-ді құрады.

Әдістеменің дұрыстығы (дәлділігі) 8-Br-3-MEX субстанциясы модельді ерітіндісінің 200 нг/мл аналитикалық концентрациясын көпретті анықтауының нәтижелері бойынша 8-бром-3-метилксантиннің стандартты үлгісі қатысында жүргізілді. Алынған ерітінділер жоғарыда көрсетілген ЖЭСХ әдісімен талданды. Модельді ерітінділерден субстанцияның орташа бөлініп шығу дәрежесі 97,90%-ды құрады. Зерттеу нәтижелері 2-ші кестеде көрсетілген.

Алынды, нг

Табылды, %

Метрологиялық сипаттамалар (ҚР МФ, 1.т, 100.б)

200,0512

96,33

n = 5

199,6433

98,14

хорт = 97,90

199,8592

98,09

SD = 1,18

200,3568

97,10

RSD = 1,65

199,9113

99,85

εорт,% = 2,03

Кесте 2 – 8-Бром-3-метилксантиннің сандық анықтау әдістемесінің дұрыстығын бағалау

2-ші кестеде көрсетілген зерттеу нәтижелері әдістеменің дұрыстығын (дәлдігін) сипаттайды. Әдістеменің дұрыстығын әдістің жүйелі қателігін және талданатын үлгінің дәл өлшенген санын бөлініп шығу пайызы түрінде көрсетті.

Енгізілді, нг/мл

Хр.шыңның S(h)

Табылғаны, мкг/мл

SD, (n=6)

RSD, % (n=6)

ε, %

(n=6)

Z

 

8974

149,11

       

8911

148,67

Кесте 3 – Әдістеменің тәулік бойындағы дәлділігі (intra-day). №1 реттік анықтау

14

150

9004

149,89

149,38

0,1778

1,1314

1,58 %

8956

148,95

8998

149,42

8987

149,35

200

11932

198,23

199,20

0,5046

1,6697

1,67 %

11898

201,19

11947

200,96

11956

197,85

11891

198,87

11925

199,21

250

15005

248,95

248,91

0,5692

1,2520

1,25 %

15078

251,01

15084

249,17

15081

248,05

14095

247,98

14098

250,08

Әдістеменің дәлділігі (прецизиондығы). Концентрациясы 3 мкг/мл, 4 мкг/мл, 5 мкг/мл 8-бром- 3-метилксантиннің стандартты ерітіндісі құйылған 3 үлгіге талдау жүргізілді. Әрбір ерітіндіні 6 реттен хроматографирленді. Зерттеу жұмыстары 1 тәулік бойында (intra-day) және 2-ші күні (inter-day) жүргізілді. Алынған концентрация шамаларының стандартты ауытқулары (SD), салыстырмалы стандартты ауытқулары (RSD, %) және салыстырмалы қателіктері (ε, %) есептеліп, 3-ші және 4-ші кестелерде көрсетілген.

3-ші және 4-ші кестелерде көрсетілгендей, салыстырмалы стандартты ауытқуы №1 реттік анықтауда 1,1314-тен 1,6697% -ға дейін, ал № 2 анықтауда 1,7004-тен 2,1148%-ға дейінгі мәндерді құрады, бұл шама жіберілетін стандартты ауытқудан аспайды, яғни жасалған әдістеменің дұрыстығы мен прецизиондығын дәлелдейді.

Салыстырмалы стандартты ауытқудың табылған шамалары (прецизион-дығы) және салыстырмалы қателігі (дұрыстығы), бірінші реттік анықтауда 1,25-1,67 % аралығында және екінші реттік анықтауда 1,70-1,95 % аралығында екені байқалды, бұл жіберілетін нормаға сай екендігін көрсетті (2,0%-дан артық емес).

Тұрақтылығы. 150-250 нг/мл концентрация деңгейінде хроматографиялық талдауға 8-бром-3- метилксантиннің стандартты ерітінділерінің тұрақтылығы зерттелді. Қысқа мерзімді тұрақтылық дайындалған үлгінің 24 сағат аралығында, және келесі күнгі талдау барысында зерттелді. Ұзақ мерзімді тұрақтылық зерттелетін заттың хроматографирлеу мерзімі 14 күн аралығында 2-8ºC температурада анықталды. Хроматографирлеу шыңы көлемінің келесі күнгі талдау кезіндегі өзгерісі 5%-дан аспады.

Кесте 4 – Әдістеменің 2-ші күнгі дәлділігі (inter-day). №2 реттік анықтау

Енгізілді, мкг/мл

Хр.шыңның S(h)

Табылғаны, мкг/мл

SD, (n=6)

RSD, % (n=6)

ε, %

(n=6)

Z

150

8896

147,68

147,28

0,4234

2,1148

1,95 %

8843

146,97

8908

147,94

8856

147,05

8873

147,16

8837

146,88

200

11867

196,90

196,93

0,2540

1,7004

1,70 %

11891

197,03

11858

196,87

11885

195,92

11898

196,86

11925

198,05

 

14935

247,72

247,57

0,5442

1,8397

1,84 %

14942

246,77

250

14991

248,03

       

14897

248,11

14972

246,92

14967

247,87

Әдістеменің қайталанғыштығын анықтау үшін 9 сыналатын ерітінді дайындалды. Зерттелетін заттың және концентрациясына көптеген жеке анықтаулар жүргізгенде талдау нәтижелерінің сенімді дәл келуі аналитикалық әдістеменің қайталанғыштығын көрсетеді. Зерттеу барысында субстанция ерітінділерінің салыстырмалы қателігі ±0,44 % құрады, сандық анықтауға жасалған ЖЭСХ әдістемесін валидациялау, оның сапасын сенімді бағалауға мүмкіндік берді (кесте 5).

Кесте 5 – 8-Бром-3-метилксантиннің сандық анықтау әдістемесінің қайталанғыштығын бағалау

Табылған мөлшері, Хi, %

Метрологиялық сипаттамалары (ҚР МФ т.1, 100б.)

n

хорт

S

∆хорт

хорт±∆хорт

ε орт,%

98,65

9

99,26

0,570

0,09

99,15±0,09

0,44

98,50

99,75

99,93

99,98

98,75

99,06

99,03

98,78

Қорытынды. Валидациялық сипаттамалар көрсеткіштерінің нәтижесінде, 8-бром-3-метилксантин субстанциясының сандық мөлшерін анықтау әдістемесі жасалынды. ЖЭСХ үшін жасалған әдістемеде субстанциядағы зерттеу нысанының сандық мөлшерін анықтау үшін спецификалығы жеткілікті болды, себебі аналитикалық аймақта ерітіндідегі 8-бром-3-метилксантин-нің жұмысшы концентрациясы дұрыс дәлдігі субстанцияның сапасын бағалауға сенімді болып табылды. Құрамы метанол-судан (35:65) тұратын жылжымалы фазасы әдістің селективтілігін қамтамасыз етті, 8-Br-3-MEX субстанциясының хроматографиялық шыңның ұсталу уақыты t1 6,42±0,02 аралығында. Орташа нәтиженің салыстырмалы қателігі ± 0,44%, бұл әдістің қайталанғыштығы жоғары екенін дәлелдейді.

Әдебиеттер

  1. Kokubo , Y . Hypertension Is a Risk Factor for Several Types of Heart Disease: Review of Prospective Studies. / Kokubo Y, Matsumoto C // Adv Exp Med Biol . – 2017. - №956. – Р. 419-426. PMID: 27815926
  2. Lu , L . The Inflammatory Heart Diseases: Causes, Symptoms, and Treatments./ Lu L , Sun R, Liu M, Zheng Y, Zhang P. // Cell Biochem Biophys. – 2015.- №72(3). – Р. 851-855. PMID: 25682012
  3. Бидайбек Р.Н., Ордабаева С.К., Асильбекова А.Д., Шарипов И.М./ Жаңа биологиялық белсенді пурин туындысын зерттеу// Оңтүстік Қазақстан мемлекеттік фармацевтика академиясының хабаршысы. – № 4 (81). – 2017. – Т. IV. – 151-152 б.
  4. Бидайбек Р.Н., Ордабаева С.К., Халиуллин Ф.А.,Шарипов И.М./ Жаңа биологиялық белсенді пурин туындысының өзі екендігін спектроскопиялық әдіспен анықтау// Оңтүстік Қазақстан медицина академиясының хабаршысы. – № 4 (84). – 2018. – Т. VІІ. – 134-136 б.
  5. Бидайбек Р.Н., Ордабаева С.К., Халиуллин Ф.А.,Шарипов И.М./ Жаңа биологиялық белсенді пурин туындысының өзі екендігін анықтаудың спектрофотометриялық әдістемесін жасау// Оңтүстік Қазақстан медицина академиясының хабаршысы. – № 4 (84). – 2018. – Т. VІІ. – 136-137 б.
  6. Бидайбек Р.Н., Ордабаева С.К., Халиуллин Ф.А., Шарипов И.М., Жантуриев Б.М./ Жаңа биологиялық белсенді пурин туындысының сандық мөлшерін анықтаудың спектрофотометриялық әдістемесін жасау// Научный и информационно-анлитический журнал «Фармация Казахстана». - №1 (210). – 2019. – С. 17-20.
  7. Ордабаева С.К., Бидайбек Р.Н., Шарипов И.М., Жантуриев Б.М./ 8-Бром-3-метилксантин субстанциясын талдаудағы жұқа қабатты хроматография әдістемесі// Международный профессиональный журнал «Медицина». - № 2 (200). – 2019. – С. 24-28.
  8. Бидайбек Р.Н., Ордабаева С.К., Шарипов И.М., Айтымбетова А.Н./ Разработка методики анализа тонкослой-ной хроматографии субстанции 8-бром-3-метилксантина// Сборник материалов XXVІ Российского националь-ного конгресса «Человек и лекарство». – Москва, РФ. – 2019. – 100 с.
  9. Қазақстан Республикасының Мемлекеттік Фармакопеясы.- Алматы: «Жібек жолы» баспа үйі.-2008.-Том 1.-592 б.
Жыл: 2019
Қала: Шымкент
Категория: Медицина