Активация синтеза арглабина в суспензионной культуре полыни гладкой

Применение в качестве сырья для получения биологически активных соединений культуры кле­ток и тканей приобретает в последнее время особую актуальность. Изыскание путей компенсации дефицита некоторых видов лекарственных растений привело к использованию принципиально ново­го метода получения отдельных биологически активных соединений растительного происхождения, в котором в качестве сырья используются изолированные ткани и клетки, растущие на искусственных питательных средах. Интерес к этому методу непрерывно растет, так как в настоящее время доказано, что, помимо способности растительных клеток синтезировать биологически активные вещества са­мого различного типа действия (антивирусного, противоопухолевого, антибиотического), клетки культуры тканей могут быть использованы для биотрансформации ряда соединений как источник для получения протеолитических ферментов [1].

Благодаря методам биотехнологии появляется возможность получать биомассу ценных проду­центов биологически активных веществ независимо от климатических условий и времени года. Наи­более целесообразно использование глубинной технологии выращивания клеток высших растений, так как это позволяет использовать стандартное микробиологическое оборудование. Большой инте­рес для медицины представляют биологически активные терпеноиды, в частности, сесквитерпеновые лактоны. На базе Института фитохимии разработан и введен в клиническую практику противоопухо­левый препарат «Арглабин», основу которого составляет одноименный сесквитерпеновый лактон.

Практическому использованию культуры клеток растений в качестве исходного сырья препятст­вует одно очень важное обстоятельство. Как показывают проведенные экспериментальные работы, в культурах клеток, как правило, резко снижается способность к синтезу вторичных метаболитов [2]. Это объясняется прежде всего тем, что в таких культурах частично теряется способность к реализа­ции генетической информации, относящейся ко вторичному обмену. Скорее всего, это связано с по­терей организменного контроля и переходом к популяционным механизмам регуляции метаболизма клеток. В основе физиологического регулирования процессов вторичного синтеза лежит изучение влияния таких факторов культивирования на рост и метаболизм клеток, как регуляторы роста, мине­ральные вещества, витамины, сахара, свет, аэрация, температура.

Можно предположить, что чем ближе клетка или группа клеток по уровню организации к цело­му растению, тем более вероятно, что в них будут реализовываться метаболические пути, характер­ные для целого организма. Вторичный метаболизм — это особенность дифференцированных расти­тельных клеток и тканей. Он присущ только специализированным органам и только определенным фазам развития растений [3]. Имеющиеся в литературе данные о положительной корреляции между накоплением вторичных метаболитов и степенью дифференцировки в культурах клеток подтвержда­ют этот факт [4]. Исследования китайских ученых показали, что выход артемизинина при культиви­ровании полыни однолетней в биореакторах увеличивается, когда создаются условия для появления регенерантов в клеточной суспензии [5]. Выявлена также взаимосвязь между морфогенезом и образо­ванием эфирных масел в культурах тканей полыни лимонной [6] и гладкой [7].

 

Учитывая все эти факторы, важно было рассмотреть возможность увеличения синтеза целевого вещества в суспензионной культуре полыни гладкой за счет получения агрегированной морфогенной культуры.

Материал и методы исследования

Объектом исследования является суспензионная культура полыни гладкой (Artemisia glabella Kar. et Kir.) — эндемичного растения Центрального Казахстана.

Пересадку культивируемых объектов осуществляли в ламинарном боксе ЛБ-Г с продувкой сте­рильным воздухом. Культивирование суспензий клеток проводили в аппарате культивирования УВМТ-12-250, в конических колбах на 250 мл.

Культивационные среды и посуда стерилизовались в автоклаве при 1,2 атмосферы в течение 20 мин. Скорость роста оценивали по значению ростового индекса (РИ), вычисляемого по формуле

В экспериментах по культивированию тканей использовали общие методические приемы, опи­санные в монографиях Р.Г.Бутенко [8], Ф.Л.Калинина и других [9].

Основными факторами, влияющими на дедифференциацию эксплантов и морфогенетические процессы в культуре клеток, являются ауксины и цитокинины. В качестве ауксинов использовали 3-индолилуксусную кислоту (ИУК), нафтилуксусную кислоту (НУК), 2,4 -дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4 -Д); в качестве цитокининов — 6-бензиламинопурин (БАП) и кинетин.

Культивирование суспензионной культуры клеток проводили в жидкой питательной среде, а растений-регенерантов — на агаризованной среде Мурасиге — Скуга [10].

Содержание арглабина в образцах биомассы суспензионной культуры полыни гладкой опреде­ляли методом ВЭЖХ на приборе HEWLETT PACKARD Agilent 1100 Series.

Результаты и обсуждение

Для получения крупных морфогенных агрегатов в суспензионной культуре мы изучали влияние различных сочетаний цитокининов (БАП, кинетин) и ауксинов (ИУК, НУК, 2,4-Д) в концентрациях 2мг/л, так как более низкие концентрации приводят к подавлению эмбриоидогенеза. Анализировали морфологические характеристики и степень агрегированности ткани в суспензионной культуре.

Среди цитокининов наиболее эмбриогенообразующим является БАП. Кинетин в исследуемых дозах не приводил к морфогенезу и формированию эмбриоидов.

Среди ауксинов наименее морфогенным оказался 2,4-Д. Суспензионная культура на среде с 2,4-Д становилась гомогенной, теряла зеленую окраску, вплоть до полного обесцвечивания, степень аг-регированности низкая, агрегаты однородные, рыхлые, мелкие, без органоподобных структур.

Использование нафтилуксусной кислоты в сочетание с кинетином также способствовало потере окраски и низкой степени морфогенеза, формирования эмбриоидов или не наблюдали совсем, или формировались очень мелкие эмбриоиды на поверхности плотных агрегатов, которые не созревали и не переходили в стадию органогенеза. В сочетании с БАП использование НУК способствовало появ­лению у культуры яркой зеленой окраски, что свидетельствует об увеличении фотосинтетической активности культуры, но, однако, эмбриоиды не были получены.

Таким образом, нами выяснено, что для морфогенеза и эмбриоидогенеза необходимо присутст­вие в культивационной среде фитогормонов БАП и ИУК. Агрегаты, полученные в среде с таким со­держанием фитогормонов, обладали наилучшим морфогенетическим потенциалом, ткань имела яр­кую зеленую окраску, выраженное эмбриогенное строение. Экстраполируя данные по влиянию фито-гормонов на морфогенез и синтез арглабина в каллусной культуре полыни гладкой [11], можно пред­положить, что данное сочетание фитогормонов приведет к увеличению синтеза целевого вещества по сравнению с клеточной суспензией.

Для подтверждения формирования эмбриоидов в суспензионной культуре полыни гладкой нами было проведено гистологическое исследование процессов, происходящих в толще агрегатов. Для это­го участки эмбриогенеза были зафиксированы для гистологического изучения. Было обнаружено формирование меристематических очагов в агрегатах суспензионной культуры полыни гладкой. Это участки активно делящихся, поэтому более мелких клеток, тесно связанных между собой, без меж­клеточного пространства. В толще меристематических очагов такого рода расположено множество сосудистых элементов (рис. 1). Постепенно происходит формирование эмбриоидов, которые на гло­булярной стадии могут иногда распадаться на деградирующие и компетентные к эмбриогенезу клет­ки. Этот процесс, возможно, объясняет механизм длительного поддержания эмбриогенного потен­циала и тотипотентности в культуре клеток полыни гладкой. Следующим этапом дифференциации является формирование биполярных зародышей, с хорошо заметными, сформированными зонами апексов корней и стебля.

Гистологическое изучение агрегатов

Процесс формирования соматических эмбриоидов происходит спонтанно и асинхронно. Гисто­логические исследования показали, что на любой фазе цикла культивирования можно обнаружить эмбриоиды на различных стадиях развития.

Следует отметить, что агрегаты суспензионной полыни гладкой можно условно разделить на два типа — рыхлые и плотные, которые отличаются между собой некоторыми морфологическими харак­теристиками и способом формирования эмбриоидов. В рыхлых агрегатах формирование глобулярных эмбриоидов происходит во всей толще ткани, тогда как в плотных агрегатах глобулы расположены преимущественно на поверхности. Кроме того, эмбриоиды, формирующиеся из агрегатов различного типа, отличались регенеративной способностью. Приживаемость регенерантов, полученных из рых­лых агрегатов, была ниже, чем у регенерантов из агрегатов плотных.

Исследователями эмбриогенеза в культуре клеток растений [12, 13] отмечено, что деградирую­щие клетки, образующиеся параллельно с формированием эмбриоидов, характеризуются признаками, которые свойственны большинству секреторных клеток растений. Это увеличение объема клеток, часто извилистая форма, утолщение клеточных стенок и наличие периплазматического пространства (плазмолиз). Возможно, что именно наличие секреторных элементов приводит к увеличению продук­тивности вторичных метаболитов в эмбриогенных тканях полыни гладкой по сравнению с культура­ми, не обладающими морфогенным потенциалом.

Таким образом, с помощью гистологического изучения суспензионной культуры полыни глад­кой подтверждено наличие морфогенеза и формирование эмбриоидов при использовании фитогор-монов БАП и ИУК в концентрациях 2 мг/л.

Для подтверждения сохранности тотипотентности в суспензионной культуре полыни гладкой были получены растения — регенеранты из эмбриогенных тканей полыни гладкой (рис. 2).

Агрегаты, представляющие собой зрелые эмбриоиды на поздней стадии, из суспензионной куль­туры высаживали на среду МС без фитогормонов, с половинным содержанием сахарозы (1,5 %). Че­рез 5 суток наблюдали формирование первых листьев, подобных семядольным, без характерных для настоящих листьев рассечений. Через 20 суток сформировавшееся растение высаживали в почвенную смесь. Культивирование растений осуществляли при температуре 20оС и искусственном освещении.

Изучение динамики роста двух типов суспензионных культур показало (рис. 3), что степень росто­вой активности агрегированной культуры выше в три раза, чем клеточной (11 и 4,6 соответственно).

При сопоставлении динамики накопления арглабина с кривыми роста суспензионных культур обоих типов видно, что в течение лаг-фазы содержание арглабина в биомассе практически не изменя­ется. В фазу логарифмического роста, т. е. при интенсивном делении клеток уровень арглабина в культуре клеток полыни гладкой падает до минимальных значений. Увеличение содержания целевого вещества в биомассе наблюдается на фазе стационарного роста, т.е. при замедлении ростовой актив­ности и снижении уровня делящихся клеток [14].

Регенерация растений полыни гладкой


Сравнение уровня синтеза арглабина у двух типов суспензионных культур показывает несо­мненное преимущество агрегированной суспензии перед клеточной (рис. 4). Количество арглабина в биомассе, выращенной в агрегированной культуре, в 4 раза больше, чем при клеточном типе суспен­зии. Этот факт подтверждают литературные данные о том, что для синтеза вторичных метаболитов необходимы дифференцированные ткани.

Таким образом, был выбран перспективный тип культивируемой суспензии, а именно агрегатная суспензионная культура полыни гладкой, в которой сохраняются морфогенетический потенциал и способность к синтезу целевого вещества на уровне, сравнимом с каллусной тканью.

Сравнение динамики ростовой активности клеточной и агрегированной суспензионной культуры полыни гладкой

Сравнение накопления арглабина в суспензионных культурах клеточного и агрегированного типа

Выводы

  1. Оптимизирован состав фитогормонов для эмбриогенеза: ИУК — 2мг/л, БАП — 2мг/л. Гистоло­гическими исследованиями доказано формирование эмбриоидов в агрегатах суспензионной культуры.
  2. Исследована взаимосвязь между дифференциацией и уровнем синтеза арглабина. Количество арглабина в биомассе полыни гладкой увеличилось в 4 раза по сравнению с недифференцированной культурой и достигло 0,38 % от сухого веса.

 

 

Список литературы

1      Чиков П.С. Растения — один из важнейших источников лекарственных средств // Химико-фармацевтический журнал. — 1986. — № 1. — С. 97-104.

2      Пасешниченко В.А. Растения — продуценты биологически активных веществ // Соросовский образовательный жур­нал. — 2001. — Т. 7. — № 8. — С. 171-182.

3      Лукнер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных. — М.: Мир, 1979.

4      Загоскина Н.В. Метаболизм фенольных соединений в связи с дифференциацией растительной клетки в условиях in vitro // Физиология растений — наука III тысячелетия: Тез. докл. междунар. конф. — М., 1999. — С. 581-582.

5      Liu C.Z., Wang Y.C., Guo C., OuyangF., Ye H.C., Li G.F. Production artemisinin by shoot cultures of Artemisia annua L.In a modified inner-loop mist bio reactor // Plant Sci. — 1998. — № 2. — P. 211-217.

6      Барвина Т.В., Воробьёв А.С., Константинова Т.Н., Сергеева Л.И., Зальцман О.О. Морфогенез и образование эфир­ных масел у полыни лимонной // Молекул. генет. микробиол. и вирусол. — 1994. — № 4. — С. 18.

7      Amanov S.B., Andreeva A.P. Phytohormones ratio for Artemisia glabella in vitro cultivation.// В сб. «Medicinal raw material and phytopreparations for medicine and agriculture». — Karaganda, 1999. — P. 190.

8      Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. — М.: Наука, 1964. — 250 с.

9      Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Метод культуры изолированных тканей в физиологии и биохимии рас­тений. — Киев: Наука, 1980. — 488 с.

10   Murashige I., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiology Plant. — 1962. — № 15. — Р. 473-497.

11   Аманов С.Б. Изучение роста, морфогенеза культуры клеток полыни гладкой и синтеза в ней биологически активного сесквитерпеноида арглабина: Автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.23. — Кольцово, ГНЦ ВБ «Вектор», 2001. — 28 с.

12   Денебаева М.Г. Цитофизиологические особенности длительно культивируемых эмбриогенных каллусных тканей яч­меня: Автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.12. — Алматы: Ин-т физиологии, генетики и биоинженерии растений, 2003. — 30 с.

13   Амирова А.К. Соматический эмбриогенез и регенерация растений в длительно культивируемых каллусных тканях пшеницы: Автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.12. — Алматы: Ин-т физиологии, генетики и биоинженерии растений,2004. — 30 с.

14   Додонова А.Ш., Аманов С.Б., Адекенов С.М. Суспензионная культура полыни гладкой — источник сесквитерпенового лактона арглабина // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Третий междунар. конгресс — М., 2005. — С. 80.

Фамилия автора: А.Ш.Додонова
Год: 2010
Город: Караганда
Категория: Биология
Яндекс.Метрика